表沒食子兒茶素沒食子酸酯對2型糖尿病大鼠認知功能的影響及其機制研究

劉行海，徐策，買文麗，鄭倩，劉華，劉紅

(川北醫(yī)學院生理學教研室，四川 南充 637000)

認知障礙是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的重要慢性并發(fā)癥，病情加重會進展為癡呆，從而降低患者生活質量，增加患者病死率，然而其發(fā)病機制目前尚未完全明了[1]。近年來，研究[2]發(fā)現炎癥反應參與了T2DM認知障礙的發(fā)生發(fā)展。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)作為綠茶主要生物活性成分之一，具有抗氧化、抗凋亡、降血脂及神經保護等作用[3-4]。本研究以海馬組織炎癥為切入點，觀察EGCG對T2DM認知障礙的改善作用是否與抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)及核因子-κB p65(NF-κB p65)的表達有關，以期為EGCG臨床用于T2DM認知障礙防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

30只清潔級雄性Wistar大鼠，體重為(195±16)g，由川北醫(yī)學院動物中心提供。鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；血清胰島素檢測試劑盒(北京北方生物技術研究所)；血糖儀(長沙三諾科技公司)；EGCG(上海源葉生物科技有限公司)；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；BCA蛋白檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；NF-κB p65抗體、β-actin抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；水迷宮計算機圖像實時分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 T2DM動物模型建立、分組及干預 從30只大鼠中隨機分出8只作為對照組，另22只參照文獻[5]方法建模。以空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)>7.8 mmol /L，同時伴有胰島素敏感指數(insulin sensitivity index，ISI)降低，作為復制T2DM模型成功的判斷標準[6]。實驗中實際建模成功17只大鼠，將其隨機分成EGCG組(n=8)和模型組(n=9)。EGCG組灌胃給EGCG，劑量為40 mg /kg，1次/d，對照組和模型組每次灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)4周。期間各組大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2.2 Morris水迷宮法測試認知功能 大鼠干預4周后進行水迷宮實驗[7]：(1)定向航行實驗，歷時5 d，記錄逃避潛伏期，即2 min內尋找平臺所需時間；(2)空間探索實驗，記錄大鼠在2 min內跨越原平臺所在位置的次數。

1.2.3 標本采集與指標測定 水迷宮測試實驗完成后，空腹12 h，經心臟穿刺采血制備血清標本，保存于-80 ℃待測。快速斷頭取腦，冰上分離海馬組織，保存于-80 ℃待測。血糖儀測定FBG；按試劑盒說明書檢測FINS水平及海馬組織TNF-α和IL-6含量。

1.2.4 Western blotting檢測海馬組織NF-κB p65蛋白表達 稱取海馬組織，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白通過10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，采用半干式轉膜法轉至PVDF膜，封閉，加入NF-κB p65一抗(1∶300)及β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，用TBST洗滌膜3次，每次10 min。采用化學發(fā)光法顯色，以β-actin為內參，image J軟件圖像分析系統(tǒng)對條帶進行灰度分析。NF-κB p65蛋白的相對表達水平用NF-κB p65蛋白與內參β-actin灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 一般情況比較

與對照組比較，模型組大鼠具有飲水量增加，食量增加，尿量增加，但是活動卻明顯減少，反應較遲鈍，毛發(fā)顯晦暗等糖尿病典型癥狀。在實驗進程中，模型組大鼠體重有減少趨勢，但上述其它癥狀和體征更加明顯。EGCG組大鼠上述情況均有改善。

2.2 認知功能實驗結果比較

與對照組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期增加，跨越原平臺位置的次數減少(P<0.05)；與模型組比較，EGCG組大鼠的逃避潛伏期減少，跨越原平臺位置的次數增加(P<0.05)。見表1。

表1 認知功能實驗結果比較

2.3 FBG、FINS和ISI比較

與對照組比較，模型組大鼠的FBG和FINS升高，ISI降低(P<0.05)；與模型組比較，EGCG組大鼠的FBG和FINS降低，ISI升高(P<0.05)。見表2。

表2 FBG、FINS和ISI比較

2.4 海馬組織TNF-α和IL-6含量比較

與對照組比較，模型組大鼠海馬TNF-α和IL-6含量升高(P<0.05)；與模型組比較，EGCG組大鼠海馬TNF-α和IL-6含量降低(P<0.05)。見表3。

表3 海馬TNF-α和IL-6含量比較

2.5 海馬組織NF-κB p65蛋白表達比較

與對照組比較，模型組大鼠海馬NF-κB p65蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，EGCG組大鼠海馬NF-κB p65蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖1。

3 討論

本課題組既往研究發(fā)現，采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素，能復制出臨床癥狀和學習記憶相近的T2DM大鼠模型，而給予EGCG 10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg灌胃治療后，尤其以40 mg/kg劑量效果最好。本實驗中，模型組大鼠出現了明顯的空間學習記憶減退，即逃避潛伏期明顯延長，跨越原平臺位置次數減少；經EGCG 40 mg/kg治療后的大鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨越原平臺位置次數增多，提示EGCG可以改善T2DM大鼠空間學習記憶的減退。

腦內炎癥反應是T2DM認知障礙重要發(fā)病機制之一。NF-κB是炎癥起始的核心調控因子[8]。有研究[9]表明，激活的NF-κB轉位到細胞核，可誘導多種細胞因子如TNF-α、IL-6、細胞粘附分子、C反應蛋白和趨化因子等的基因表達。國內外研究[10-11]結果表明，通過抑制NF-κB通路活化可達到抗炎效果。TNF-α和IL-6是體內重要的促炎細胞因子。學習記憶是認知功能的主要方面，而腦海馬組織是學習記憶的重要整合中樞。有研究[12]報道，海馬區(qū)中小膠質細胞活化后將產生大量IL-6、IL-1β等炎癥因子，導致腦內免疫反應加重及大量細胞死亡，從而進一步損害學習記憶能力。還有研究[13-15]證實，TNF-α和IL-6在學習記憶能力減退的大鼠海馬組織中的表達明顯升高，通過減少炎癥因子TNF-α和IL-6的表達可有效改善糖尿病大鼠認知功能。本實驗發(fā)現，與對照組比較，模型組海馬組織活化的NF-κB增加即NF-κB p65亞基蛋白表達增多，炎癥因子TNF-α和IL-6含量升高，也進一步證實T2DM大鼠的海馬組織存在明顯的炎癥。給予EGCG治療后，大鼠海馬組織NF-κB p65蛋白表達、炎癥因子TNF-α和IL-6含量均顯著低于模型組，提示EGCG通過降低海馬組織中NF-κB的活化，減少炎癥因子TNF-α、IL-6的產生，減輕海馬組織炎癥反應，進而改善T2DM大鼠空間學習記憶能力。

綜上所述，EGCG能明顯抑制T2DM大鼠海馬炎癥因子TNF-α，IL-6的產生以及NF-κB p65蛋白表達，并顯著改善T2DM大鼠空間學習記憶能力，其可能的機制是通過減輕海馬炎癥反應，從而起到神經保護作用。但EGCG對T2DM大鼠認知功能的改善可能存在多部位、多途徑的作用機制，其具體機制仍有待深入研究。