烏頭內(nèi)生細菌具有抑菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì)研究

瑪依拉·吐爾地別克

(伊犁師范大學，新疆 伊寧 835000)

植物內(nèi)生細菌是指能夠在健康植物組織內(nèi)繁殖，且與宿主植物建立共生關(guān)系狀態(tài)的一類微生物，具有生物防治、植物促生長和內(nèi)共生固氮等作用[1]。通常由于內(nèi)生細菌與宿主植物存在長期的共生關(guān)系，從而造成這類細菌的種群結(jié)構(gòu)及生物學功能不同于其土壤細菌和植物根際細菌，其中，可與宿主植物產(chǎn)生相同或相似的次生代謝產(chǎn)物為這部分內(nèi)生菌的特點[2]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，目前大部分藥用植物生長周期長，提取有效成分步驟繁瑣，生物藥學資源量較少，對于和植物產(chǎn)生共生關(guān)系的內(nèi)生微生物的生長周期短，最重要的內(nèi)生菌可產(chǎn)生與宿主植物相似的一些次級代謝產(chǎn)物，可以有效利用微生物來產(chǎn)生具有藥用價值的次級代謝產(chǎn)物，也可豐富生物資源[3]。作為中藥的烏頭類植物，具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎、抗休克、擴張外周血管、抗氧化等作用。目前對于烏頭的研究報道常見于其藥效、有效藥用成分的提取、毒性、種植、田間管理和病蟲害的防治等[4]。綜上述研究可知，許多植物中的天然化合物與其內(nèi)生菌具有密切聯(lián)系，甚至是內(nèi)生細菌的次級代謝產(chǎn)物，這也就造成國內(nèi)外學者陸續(xù)加強對植物內(nèi)生菌的研究，由此發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生細菌產(chǎn)生抗癌物質(zhì)，為解決抗癌藥物的供應(yīng)問題開辟一條新道路。從上述研究結(jié)果可知，烏頭的許多化學成分均具有抗腫瘤、抗菌和鎮(zhèn)痛等生物學活性，且表現(xiàn)廣泛，具有良好的開發(fā)潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用供試菌株YACX-1、YACX-2、YACX-3的3株菌株為具有抑菌活性內(nèi)生細菌，指示菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)CGMCC1.1103株，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.769，均由伊犁師范大學生物與地理科學學院微生物實驗室保存。主要培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化

將實驗室所保藏的已分離、純化保存的3株內(nèi)生細菌種接于NB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)活化3代，并儲存于4℃冰箱備用。同時將作為指示菌的大腸桿菌、枯草芽胞桿菌的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基上，于37℃下培養(yǎng)，并儲放于4℃冰箱，備用于抑菌試驗。

1.2.2 具有抑菌活性內(nèi)生細菌發(fā)酵液的制備

將活化好的3種菌株接種于NB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，8000r·min-1，20min，取上清液，置于4℃的冰箱中保存并使用。

1.2.3 不同發(fā)酵條件對抑菌活性物質(zhì)的影響

在NB培養(yǎng)基上接種活化好的3種菌株，分別將溫度為28℃、37℃、42℃和pH設(shè)置為6.0、7.0、8.0，其中培養(yǎng)時間可分別設(shè)置成16h、24h，再離心收集上清液，用0.22μm過濾器過濾除菌，將100mL發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1mL后觀察抑菌圈大小。

1.2.4 不同熱處理和不同pH對菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

吸取100μL供試菌菌懸液加入平板表面，用涂布器將菌液涂布均勻。在溫度和pH的處理中將具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌的3種菌株發(fā)酵液分別置于溫度45℃、60℃、80℃、100℃下熱處理10min，設(shè)置pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，過夜培養(yǎng)。之后即可采用紙片法對不同菌株設(shè)置2個重復，將紙片放入含有指示菌的待測培養(yǎng)皿中，放置于37℃下，過夜培養(yǎng)，并用游標卡尺測抑菌圈直徑并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌發(fā)酵液隨不同pH值、時間及溫度的變化情況

在3種菌株分別對2種指示菌的抑菌活性的檢測中由圖1至圖3中可知，YACX-1、YACX-2、YACX-3等3株菌株的發(fā)酵液在pH值為7，時間為16h時抑菌效果最佳。在最適pH和時間為基礎(chǔ)的情況下，可將溫度分別調(diào)節(jié)設(shè)為28℃、37℃、42℃時，可得出菌株的最適生長溫度為37℃。由此可表明，具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌最適生長條件為37℃，pH值為7，時間為16h。

圖1 28℃下3株具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌的抑菌活性

圖2 37℃下3株具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌的抑菌活性

圖3 42℃下3株具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌的抑菌活性

2.2 具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌對熱處理的穩(wěn)定性

具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌經(jīng)過不同的溫度處理時，其抑菌大小(mm)效果的變化如圖4可知，YACX-1、YACX-2、YACX-3所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在45℃抑菌效果最好，抑菌圈分別可達到8mm、10mm、9mm，在60℃、80℃和100℃，10min處理后有所降低。綜上所述，YACX-2菌株抑菌性耐高溫，故而在后期的內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物中可有效利用并進行研究。

圖4 不同溫度下具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌抑菌活性穩(wěn)定性檢測

2.3 具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌對pH穩(wěn)定性

具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌對不同pH的穩(wěn)定性如圖5所示，在pH值為4時，YACX-1、YACX-2和YACX-3均無生長；對大腸桿菌的抑菌效果從強到弱為，在pH值為5時，YACX-2>YACX-3>YACX-1；在pH值為6時，YACX-2、YACX-1>YACX-3；在pH值為7時，YACX-2>YACX-3>YACX-1；在pH值為8時，YACX-3>YACX-2>YACX-1。對枯草芽孢桿菌的抑菌效果從強到弱為，在pH值為5時，YACX-3>YACX-2>YACX-1；在pH值為6時，YACX-1、YACX-2>YACX-3；在pH值為7時，YACX-2>YACX-1>YACX-3；在pH值為8時，YACX-2>YACX-3>YACX-1。綜上述可知，具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌在酸性條件下不易生長，卻較為耐堿，這可為內(nèi)生細菌的活性物質(zhì)的研究打下基礎(chǔ)。

圖5 具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌對不同pH抑菌性的檢測

3 討論

在本試驗中，對具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌抑菌活性的最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化包括對溫度、pH、時間的研究。分別將培養(yǎng)溫度設(shè)為28℃、37℃、42℃，pH為6、7、8，培養(yǎng)時間為16h、24h的條件下采用紙片法測定抑菌圈的大小。結(jié)果可知，菌株的最適培養(yǎng)條件為37℃、pH值為7、時間為16h。在對于具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細菌的生物學特性研究中，其YACX-1菌株具有良好的熱穩(wěn)定性，耐高溫，抑菌活性也較為穩(wěn)定，而烏頭內(nèi)生細菌在堿性條件下抑菌活性由強到弱依次為YACX-2>YACX-1>YACX-3。由此可知，烏頭內(nèi)生菌耐堿、耐高溫，故而可在后期研究中有效利用烏頭內(nèi)生細菌次級代謝產(chǎn)物，并用于藥用植物烏頭活性成分的分離提取與純化，這也恰恰表明了烏頭許多有效成分表現(xiàn)廣泛，具有較好的開發(fā)潛力，可為抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和抗菌性等打下良好的基礎(chǔ)，且表明了烏頭內(nèi)生細菌具有重要的開發(fā)價值，為尋找具有抗菌、耐高溫的活性次生代謝產(chǎn)物可有效利用提供參考依據(jù)。