高遷移率族蛋白B1、基質金屬蛋白酶-9及血管內皮生長因子在肺癌患者組織中的表達及臨床意義研究

馮 為

(佳木斯中心醫院 胸外科,黑龍江 佳木斯154000)

近年來，肺癌的患病率及病死率呈現逐年升高的變化趨勢，雖采取相應的治療，但患者生存率及生存周期均較小，對患者生命健康造成較大的威脅。特別是對于非小細胞肺癌而言，即使經積極治療，但是仍會復發甚至癌癥病灶存在遠處轉移的問題，嚴重困擾著臨床醫師。相關文獻報道稱：多種基因參與調控肺癌的侵襲轉移過程[1-3]。高遷移率族蛋白B1(High mobility group box1,HMGB1)屬于一組非組蛋白的核蛋白，目前已發現其參與了多種惡性腫瘤的侵襲以及轉移過程中[4]；基質金屬蛋白酶-9(Matrix metallopmteinase-9，MMP-9)作為基質金屬蛋白酶家族中相對分子質量最大的一種蛋白酶，也參與了惡性腫瘤的浸潤以及轉陰過程中[5]，其可能機制為：由于在較大的腫瘤組織內部，壞死的腫瘤細胞會釋放出大量的HMGB1并作用于纖溶系統，對基底膜以及細胞外基質產生破壞所致。惡性腫瘤細胞可經自分泌或旁分泌的血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)誘使腫瘤淋巴管產生，從而加快腫瘤細胞的侵襲與轉移過程。HMGB1能夠對核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白及絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信號通路具有激活作用，這些信號路徑已在某些惡性腫瘤中證實與MMP-9及VEGF地表達調節相關[6-7]。目前，臨床關于HMGB1、MMP9以及VEGF同時在肺癌組織中的表達情況及其與病理學關系方面的研究報道尚較少。本研究主要通過分析如上內容，旨在探討上述3種因子在肺癌組織中的表達意義及其可能作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年11月至2019年11月期間佳木斯中心醫院收治的90例肺癌患者作為研究對象，對術中所切除的肺癌組織及其癌旁組織進行收集。入選標準：(1)均經術后病理學檢查確診，且均為初次確診；(2)經術后生存期評估，患者生存期在3個月以上；(3)患者對本研究方案知情同意，且經醫院倫理委員會批準(審批號：SP20171025)。排除標準：(1)既往接受放、化療治療；(2)合并其他惡性腫瘤疾病患者；(3)嚴重的心肝腎等器質性病變者；(4)中途死亡退出研究者。本研究入選的90例肺癌患者中，男、女分別為51例、39例；年齡48-78歲，平均(64.52±10.22)歲；組織學類型：腺癌、鱗癌分別為47例、43例；淋巴結轉移49例；分化程度：高、中、低分化例數分別為25例、38例、27例。本研究中所獲取的肺癌組織及其癌旁組織標本均于手術切除之后立即予以處理，以有效規避因組織細胞的結構、化學成分、物理性質等的改變而對實驗結果產生的影響，將標本置于濃度為10%的福爾馬林溶液(pH=7.0)中進行固定，采用石蠟包埋之后連續進行切片處理。

1.2 免疫組化方法首先取切片，將其烘烤1 h，應用二甲苯Ⅰ、Ⅱ對其進行脫蠟處理，使用濃度梯度分別為100%、95%、80%及70%的酒精進行水化處理，自來水重復沖洗2次，5 min/次。滴加濃度為3%的雙氧水，在避光條件下孵育10 min，采用PBS沖洗3次，3 min/次。然后將其浸入枸緣酸鈉緩沖液之中，使用高壓鍋修復抗原熱，并于山羊血清中封閉1刻鐘。使用濾紙將血清吸去，將已稀釋好的一抗滴加進去(HMGB1、MMP-9及VEGF多克隆抗體均購自于上海欽誠生物科技有限公司)，于4℃溫度條件下過夜進行處理，并于室溫狀態下放置1 h，PBS重復沖洗2次，5 min/次，將生物素化的二抗滴加其中，于37℃溫度條件下反應20 min，再次使用PBS重復沖洗2次，5 min/次，向其中加入鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex,SABC)，于37℃條件下靜置20 min，采用PBS重復沖洗2次，5 min/次。DAB顯色，蘇木素溶液復染10 min，采用鹽酸酒精分化處理。采用濃度分別為80%、95%、100%、100%的梯度酒精進行脫水處理，然后使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ進行透明處理，將一定量的中性樹膠滴入其中，封片晾干。

1.3 結果判定對于每個手術切片隨機選取8個視野，于高倍鏡(×400)下進行觀察。HMGB1、VEGF細胞核與細胞質呈現出棕黃色為陽性，MMP-9細胞質呈棕黃色為陽性。對每個視野下的HMGB1及VEGF陽性細胞數量進行統計分析，對其陽性細胞率進行計算，對8個視野下的陽性細胞率平均水平進行計算，陽性細胞率大于20%則計為陽性。MMP-9陽性結合染色強度以及陽性細胞率進行綜合判定：陽性細胞率<10%，記為1分；陽性細胞率在[10%,50%)，記為2分；陽性細胞率≥50%，記為3分；染色強度：無染色、淡黃色、黃色及棕黃色分別記為0分、1分、2分及3分。最終得分=陽性細胞率得分×染色強度得分，如果最終得分在3分以下，則表示為陰性，最終得分≥3分，則表示為陽性。

1.4 觀察指標(1)比較肺癌組織與癌旁組織HMGB1、MMP-9及VEGF陽性表達情況；(2)肺癌組織中HMGB1、MMP-9及VEGF的表達與病理學相關指標的關系。

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織中的HMGB1、MMP-9及VEGF陽性表達對比肺癌組織中的HMGB1、MMP-9及VEGF陽性表達率分別為63.33%、68.89%及66.67%，均分別顯著高于癌旁組織(分別為30.00%、31.11%及2.22%)(P均=0.000)，見表1。

表1 肺癌組織與癌旁組織中的HMGB1、MMP-9及VEGF陽性表達情況比較[n(%)]

2.2 肺癌組織中HMGB1、MMP-9及VEGF的表達與臨床病理學特征的關系肺癌組織中有淋巴結轉移、腺癌HMGB1、MMP-9及VEGF陽性表達率均分別顯著高于無淋巴結轉移、鱗癌(P均<0.05)，但肺癌組織中上述因子陽性表達率與年齡、性別、腫瘤直徑及分化程度無關(P均>0.05)，見表2。

2.3 肺癌組織中HMGB1、MMP-9及VEGF表達的相關性分析經Spearman相關性分析，結果顯示：肺癌組織中HMGB1陽性表達率與MMP-9及VEGF呈正相關性(r值分別為0.459、0.445，P均<0.01)；MMP-9陽性表達率與VEGF呈正相關性(r值為0.422，P<0.01)。

表2 肺癌組織中HMGB1、MMP-9及VEGF的表達與臨床病理學特征的關系

3 討論

我國肺癌的發病呈逐年上升趨勢，肺癌出現侵襲及轉移，加大了治療的難度，癌細胞的遠處轉移是造成患者死亡的一個重要原因[8-9]。本研究入選90例肺癌患者中，出現淋巴結轉移的患者49例(占54.44%)。因此，加強對肺癌患者機體相關因子表達情況及其與臨床病理學之間的關系、各因子間的相關性，對臨床診療及弄清疾病可能發病機制具有一定的參考價值。

本研究中表1結果顯示：肺癌組織HMGB1、MMP-9及VEGF陽性表達水平均顯著高于癌旁組織(P均<0.05)。此結果提示：癌旁組織中由于沒有癌細胞激發HMGB1、MMP-9及VEGF的表達，而肺癌細胞能夠激發上述因子的陽性表達，因此，肺癌組織中上述因子水平要顯著高于癌旁組織中的表達水平。上述結果與林國輝等[10]研究結果相符。本研究中表2結果顯示：肺癌組織中有淋巴結轉移、腺癌HMGB1、MMP-9及VEGF陽性表達率均分別顯著高于無淋巴結轉移、鱗癌(P均<0.05)。經分析，出現上述結果可能原因為：腫瘤細胞浸潤轉移的關鍵步驟之一是細胞外基質的降解，其中纖溶酶的激活是一個重要環節，MMP-9作為細胞外基質降解酶，能通過促進血管生成和降解細胞外基質，使腫瘤發生浸潤、轉移[11-12]；HMGB1能夠有效誘導細胞凋亡反應過程[13-15]；VEGF能夠增強血管內皮細胞有絲分裂的活性水平，VEGF是目前較為明確的淋巴管生成因子，可通過激活淋巴管內皮，刺激淋巴管增生或擴張，這些新生或擴張的淋巴管即為腫瘤細胞的淋巴轉移增加了機會[16-17]。本研究結果中表3顯示：HMGB1、MMP-9及VEGF，兩兩之間均呈顯著的正相關性(P均<0.01)。此結果說明：(1)肺癌患者機體微環境中存在的HMGBl可能與VEGF在促進肺癌的淋巴結轉移方面存在相互作用[18-19]；(2)腫瘤侵襲和轉移的機會由于新血管的生成而得到增加。腫瘤內微血管密度(Microvessel density in the tumor，MVD)是用CD34標記腫瘤血管，進行直接觀察并量化腫瘤血管生成的方法。進行相關研究發現將MVD可以作為腫瘤血管形成的標志，MVD與腫瘤的復發、轉移和預后有關。而有研究表明[20-21]：HMGB-1、VEGF、MMP-9均與MVD呈正相關關系(P均<0.05)，從而進一步證明HMGB-1、VEGF、MMP-9之間呈正相關關系；(3)HMGBl可能通過激活細胞核P13激酶/Akt和NF-kB信號通路從而誘導MMP-9的表達及癌細胞轉移。