脊髓損傷后血清miRNA-21表達與損傷程度的相關性分析

王 軍，姜利明,皮楊威,馬陽陽,趙東旭*

(吉林大學中日聯誼醫院 1.脊柱外科；2.南湖院區神經內科，吉林 長春130033)

脊髓損傷(SCI)，指由各種原因導致椎管內神經結構 (包括脊髓和神經根) 及其功能的損害,出現損傷水平及以下脊髓功能 (感覺、運動、反射等) 障礙[1]。脊髓損傷后會發生一系列病理生理變化，比如炎癥和免疫反應，神經細胞凋亡等[2]，這些變化被認為與基因表達模式的改變有關[3]，而這些改變通常伴隨基因網絡的轉錄后調控。在已知的轉錄后調控劑中，由于具有抑制mRNA翻譯的能力，微小核糖核酸(microRNAs， miR)備受學者關注，而且有研究表明 miRNA調節人類基因組中60%的基因[4]。miRNA存在于包括中樞神經系統(CNS)在內的所有系統中，參與調節神經疾病和神經外傷性疾病，例如阿爾茨海默氏癥，帕金森氏癥和亨廷頓病，圖雷特氏綜合癥和精神分裂癥[5]。有一些研究使用微陣列分析檢測了脊髓損傷后大鼠和小鼠的miRNA表達譜，這在動物模型中初步證實了幾種miRNA發生了顯著變化(如miR-21的過表達)，并確定了其中一些調節因子的潛在下游靶點[6-7]。因此，miRNA 可能廣泛影響人類脊髓損傷后病理生理反應的信號網絡，而miR-21作為動物模型中過表達的調節因子之一，在脊髓損傷患者中的表達水平仍然未知。因此，本研究旨在測定脊髓損傷后不同時間點患者血清中的miR-21水平，并基于損傷后時間、年齡和性別分析miR-21在脊髓損傷患者、非脊髓損傷患者和健康志愿者之間的差異表達模式，為脊髓損傷靶向藥物的研究和治療時機的選擇提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選擇在2018年9月至2019年9月吉林大學中日聯誼醫院脊柱外科收治的脊髓損傷患者100例為脊髓損傷組(SCI組)，這些患者都經臨床表現和影像學檢查確診無誤；非脊髓損傷組(NSCI組)為無中樞神經系統受損的患者，共納入80例，包括下肢損傷44例，上肢損傷36例；健康組為醫院體檢中心進行例行檢查的人群，共納入90例，這些人在入組前從未被診斷SCI。三組研究人群進行了年齡、性別比等基本指標的比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員會批準，符合醫學倫理學要求，在采集血樣之前，都簽署了知情同意書。

1.2 損傷程度的評價方法

脊髓損傷病人病情的嚴重程度與脊髓損傷程度有關，由具有5年以上臨床工作經驗的脊柱外科醫師根據臨床表現進行評價。完全性脊髓損傷表現為最低骶髓節段 (S4-5) 感覺和運動功能喪失 (即沒有骶殘留) ，完全性脊髓損傷應在脊髓休克結束后確定,若脊髓損傷48 h后仍表現為脊髓休克,檢查確認鞍區無感覺和運動功能,則按完全性脊髓損傷診斷；如果神經損傷平面以下,包括最低骶髓節段 (S4-5) 保留任何感覺和(或)運動功能 (即存在骶殘留)，則判定為不完全性脊髓損傷[1]。

1.3 血清制備

所有研究參與者禁食一夜后，于清晨空腹抽取4 ml外周靜脈血。血樣在室溫下放置60 min。然后在700 g，4℃下超速離心(30 000 r/min)10 min后，立即將血清從血液中分離出來，冷凍并儲存在-80℃的冰箱中留待檢測。在樣品儲存期間，避免反復凍融，以確保樣品的質量。

1.4 核酸提取和實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

根據制造商的使用說明書，使用TRIzol (Invitrogen，CA)和miRNeasy微型試劑盒(Qiagen，West Sussex，UK)分離總RNA，這樣可以有效地回收所有RNA，包括miRNA；使用NanoDrop分光光度計(ND-1000，Nanodrop Technologies)測量RNA的質量和數量，并通過凝膠電泳確定RNA的完整性；使用引物逆轉錄試劑盒(日本東京TaKaRa)將每個樣品的總RNA反轉錄成cDNA；使用SYBR Premix Ex Taq(日本東京TaKaRa)和miR-21的miRNA特異性引物(中國廣州Ribobio)進行qRT-PCR。將每個樣品的相對miRNA水平標準化為U6表達。記錄周期閾值(CT)，其定義為熒光信號高于指示基線可變性的閾值所需的聚合酶鏈反應周期數?；虮磉_的相對變化用2-ΔΔCt表示，即NSCI組和健康組miRNA-21原始拷貝數的差異。ΔΔCT= SCI組的(CTmiR-21-CTU6)-對照組的(CTmiR-21-CTU6)。

1.5 統計學處理

使用GraphPad Prism 5.01和SPSS 16.0統計學軟件進行數據處理和分析。計量資料用均數±標準差表示。統計分析采用雙向重復測量方差分析和圖基(Tukey)事后檢驗進行多重比較。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征

在SCI患者中，存活患者的平均年齡為36.12±3.56歲；48名患者年齡在35歲以上，其他患者年齡在35歲以下；大多數SCI患者(76%)是由交通事故造成的，其余患者因高處墜落而受傷；43%的患者發生頸髓損傷，其他患者發生其他部位的脊髓損傷；有57例發生了完全性脊髓損傷，43例為不完全性脊髓損傷；在整個研究期間，脊髓損傷患者的死亡率為9%。NSCI組患者的平均年齡為39.22±4.45歲(男性56例、女性24例)，其中包括36例手臂損傷和44例腿部損傷。健康組包括55例男性患者，35例女性患者，平均年齡為38.3±2.35。SCI組患者與對照組(NSCI組和健康組)患者之間的年齡和性別分布無顯著差異，見表1。

表1 脊髓損傷人群的臨床特征

2.2 相關性分析

本研究定量分析了三組人群傷后第1天、7天、28天和3個月血清miR-21的相對表達水平(見圖1)。結果顯示SCI患者血清miR-21水平在傷后第1天明顯升高，在傷后第7天達到峰值，而在傷后第28天，基本與NSCI組及對照組持平，在之后miR-21的水平維持在對照水平。然而，在NSCI和對照組中，血清miR-21幾乎沒有變化。miR-21的水平與患者性別之間沒有相關性(見圖2A)。此外，miR-21的表達水平與患者年齡也無相關性(見圖2B)。脊髓損傷后第1天和第7天，完全性脊髓損傷組血清miR-21水平明顯高于不完全性脊髓損傷組(見圖3)，表明血清miR-21水平與損傷程度有關(P<0.001)。

圖1 脊髓損傷、非脊髓損傷以及對照組(NSCI和健康志愿者)的miR-21相對表達水平變化。數據用均值±標準誤(雙向重復測量方差分析和圖基事后檢驗)表示。SCI組與對照組的差異顯著性水平用星號表示：*P<0.05，**P<0.01

圖2 不同性別(A)和不同年齡(B)的人群脊髓損傷后血清中miR-21的相對表達水平變化

圖3 完全性脊髓損傷和不完全性脊髓損傷后血清中miR-21的相對表達水平變化

3 討論

脊髓損傷根據致病因素分創傷性和非創傷性兩大類,創傷性脊髓損傷是最嚴重的損傷類型之一，交通事故和高空墜落是目前創傷性SCI 的兩大主要原因。全亞洲的SCI平均年患病率為12.1-61.6 人次/100萬[8]。近年來，脊髓損傷呈現出三高一低的發展趨勢，即高發病、高耗費、高致殘及低齡化，已成為學術界亟需攻克的重大醫療難題。創傷性脊髓損傷病理生理反應可分為三個階段，急性期為脊髓休克狀態；急性期之后的第二階段發生在傷后數分鐘或數周，包括血管改變，生化紊亂，細胞的炎癥反應和死亡；慢性期發生在傷后的數天到數年時間，這一階段的特征是細胞凋亡，瓦勒變性和瘢痕形成[3,9]。SCI發生后的病理生理變化與基因表達模式的改變有關，一方面，在損傷后的最初幾個小時內，與炎癥和細胞死亡相關的基因會強烈上調，而與細胞興奮性和神經傳遞有關的基因下調；在最初的幾周中，與炎癥和凋亡相關的基因仍持續上調，而調節細胞骨架排列，髓鞘和突觸的基因表達下降，反映出組織完整性受損。另一方面，編碼血管生長、神經生成和生長因子分泌的基因表達增加，試圖促進神經的存活和再生[3]。因此，改變miRNA的表達可能會極大地影響SCI的病理生理變化過程。在本研究中，我們發現SCI后不同時間點的miR-21血清水平有不同的變化，這進一步表明miRNA可能極大地影響SCI的病理生理和功能結局。

最近，有幾項研究證明了多個損傷模型中miR-21的異常表達。例如，微陣列分析表明，在大鼠創傷性腦損傷后多個時間點(6-72小時)測量，許多miRNA的水平都發生了改變，而大腦皮層中的miR-21始終處于高表達水平[10]。Redell等人發現嚙齒動物創傷性腦外傷(TBI)后海馬中許多miRNA的表達發生了變化，其中miR-21的表達顯著增加，表達水平在受傷后3天達到峰值，并在受傷后數天恢復到正常水平[11]。另外，有學者在大鼠體內敲除miR-21后，加重了神經功能缺陷及組織的損傷，增加了大鼠脊髓損傷后細胞的凋亡程度[12]。顯然，大部分研究主要是集中于動物模型中miR-21的表達上，這與患者有所不同。我們的研究是以患病人群為觀察組，脊髓未損傷人群和健康人群為對照組，發現脊髓損傷后不同時間點的miR-21水平有不同的變化，這可能有助于臨床醫生在脊髓損傷后選擇合適的時間應用適當的藥物進行靶向治療。