環介導等溫擴增對人乳頭瘤病毒可視化分型檢測

張可欣，楊思熙,王麗娜，劉金霞，邢恩鴻

(1.承德醫學院 病原生物學實驗中心，河北 承德067000;2.承德醫學院附屬醫院 婦科，河北 承德067000)

乳頭瘤病毒(HPV)是一種乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒，目前已發現140余種亞型[1]。不同亞型的 HPV感染所導致的后果也不同，低危型主要可導致尋常疣和良性病變，而高危型主要可導致宮頸上皮內瘤病變或者是宮頸癌[2]，最新研究表示， HPV感染也與動脈粥樣硬化和口咽癌的形成有關[3-4]。因此，早期識別HPV感染，對預防可能發生的疾病有著重要的指導作用。

目前，臨床上對于 HPV的診斷手段主要以斑點雜交或原位雜交為主[5-6]，這種方法需要配套的昂貴設備才能完成，不適用于基層醫院或社區現場進行 HPV的篩查和分型。環介導等溫擴增(LAMP)技術是在2000年由日本學者 Notomi開發的一項適用于基因診斷的技術[7]，具有特異性強、結果可用肉眼判定、無需特殊裝置的優點。本實驗將基于該技術對HPV16、18、52、58亞型臨床標本進行檢測并分型，旨在探討LAMP在臨床的使用前景。

1 材料與方法

1.1 試劑

Bst DNA聚合酶和10X reaction buffer購自美國NEB公司，鈣黃綠素購自Sigma公司，100 bp DNA Marker購自TaKaRa公司，PCR Mix購自TIANGEN公司。

1.2 標本采集

收集承德醫學院附屬醫院2018年8月-2018年10月部分就診患者宮頸脫落細胞懸液共155例，其中4例經該院檢驗科使用潮州凱普公司HPV分型試劑盒檢測后HPV16、18、52、58感染，其余151例未知亞型。

1.3 DNA模板制備

DNA模板制備將標本混合均勻后，15 000 r/min離心5 min，棄上清，留沉淀，加入50 μl核酸裂解液，100℃煮沸5 min，-20℃保存備用。

1.4 LAMP特異性引物

根據GenBank公布的HPV16亞型(GenBank登錄號： EU869318.1)、18亞型(GenBank登錄號： KY457840.1)、52亞型(GenBank登錄號： EU924144.1)和58亞型(GenBank登錄號： KU298920.1) E6、 E7區域為參考序列，應用 Clustal Omega軟件進行序列對比，選取其保守區域，用 LAMP專用引物設計軟件(Primer Explorer V5)設計每種亞型的4條引物，引物序列見表1，其中 F3和 B3為外部引物，FIP和 BIP是內部引物，所有引物均委托上海生物技術有限公司進行合成。

表1 HPV病毒的LAMP引物序列表

1.5 臨床標本的檢測

分別應用LAMP和PCR兩種檢測方法對155例臨床標本逐個檢驗。 LAMP體系根據前期體系優化結果，分別采用以下體系配置反應液(表2)，65℃水浴1 h后，置冰上停止反應，觀察可視化結果，黃色提示陰性，綠色提示陽性。 PCR擴增實驗以LAMP外引物(F3/B3)為上、下游引物。 采用25 μl體系：12.5 μl PCR Mix，1 μl F3/B3，1 μl DNA模板，其余用ddH2O補足。 擴增條件： 94℃ 3 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環;72℃ 5 min。 結果判斷：取5 μl產物，采用2% 濃度的瓊脂糖凝膠開展電泳實驗觀察結果，在凝膠成像儀下觀察電泳條帶。

表2 LAMP 反應體系

1.6 LAMP特異性檢測

通過互換模板實驗驗證 LAMP的特異性，分別以 HPV16、18、52、58亞型 DNA及雙蒸水為模板，應用4套特異性引物進行 LAMP擴增，根據瓊脂糖電泳結果和染色結果判斷引物特異性，每種亞型的特異性檢測重復4次以上。

1.7 LAMP和PCR靈敏度檢測

對經熒光定量 PCR檢測后所含菌量約為2×106IU/μ L的 HPV DNA進行梯度稀釋，對最終拷貝數分別為104、103、100、10 IU/μ L的模板，分別進行 LAMP和 PCR擴增，并通過 LAMP可視化結果及2%瓊脂糖凝膠電泳進行靈敏度分析，對 LAMP的靈敏度檢測重復4次以上。

1.8 統計學分析

應用SPSS21.0軟件比較LAMP和PCR對155例標本檢測結果的一致性。Kappa值為0.4-0.7時一致性一般，>0.7時一致性好。

2 結果

2.1 特異性實驗

分別對HPV四種亞型進行模板互換擴增實驗后，瓊脂糖電泳結果如圖1A、C所示，其中16、18、52、58所囊括的泳道分別代表使用該亞型引物進行擴增后的產物電泳圖，泳道16、18、52、58分別對應 HPV四種亞型模板。由圖可知，每種亞型的特異性引物僅可擴增該亞型模板，其余模板及陰性對照均未被擴增，表示本文中建立的 LAMP體系特異性較好，不受其他模板的擾亂。

鈣黃綠素染色效果如圖1 B、D所示，各管按排列順序同上，經比較可得兩種檢測產物方法結果一致，可通過簡單的肉眼觀察代替電泳檢測。4次重復實驗結果均與以上結果相當。

圖1 LAMP檢測HPV的特異性

2.2 靈敏度實驗

分別應用PCR和LAMP對一系列梯度稀釋后的HPV DNA進行擴增，擴增結果如圖2所示。圖2A表示HPV16亞型的LAMP檢測限為100IU/ μl，HPV18的LAMP檢測限為103IU/μL；圖2D表示HPV52亞型的LAMP檢測限為100IU/μL，HPV58亞型的LAMP檢測限為103IU/μL； 圖2C、F表示HPV16、18、52、58亞型的PCR檢測限均為103IU/μL。由此可知LAMP對HPV16、52亞型的檢測限均比PCR高一個數量級。

圖2B、E表示鈣黃綠素的可視化結果，綠色表示陽性、黃色表示陰性，排列順序同上，與電泳結果對比后可知其染色效果與電泳結果相當。4次重復實驗結果如表3所示，均與以上結果相當。

圖2 LAMP和PCR的靈敏度檢測

表3 LAMP的重復性實驗

2.3 臨床標本檢測

LAMP擴增105例經 PCR檢測為陽性的標本和50例陰性標本后，將兩種分型結果進行一致性比較，結果如表4所示。在105例經PCR確認為陽性的標本中，LAMP檢測出99例，靈敏度為94.29%。在50例經PCR確認為陰性的標本中，LAMP檢測出46例，特異性為92.0%。應用SPSS對其進行一致性檢驗和卡方檢驗后得出， LAMP與 PCR檢測有極好的一致性(Kappa值=0.854)。

表4 LAMP和PCR的一致性比較

3 討論

宮頸癌作為世界女性最多見的惡性腫瘤之一，一直受到較大重視。近年來，經研究證實，高危型 HPV的反復持續感染與其產生息息相關[8]，且不同亞型 HPV所導致的結果也不盡相同[9]。因此，早期識別HPV感染并對其進行分型檢查是防治宮頸癌的必要基礎[10]。目前國內醫院針對HPV的檢測及分型普遍為斑點雜交或原位雜交[11-13]，但需要大型儀器和昂貴的設備，不適合基層或現場檢測。因此臨床上正亟待一種更為方便、簡單的診斷方法用來補充甚至替代原有的HPV診斷方法。

本文中所使用的 LAMP技術是在2000年由日本學者 Notomi公布的一項可在恒溫狀態下進行擴增的基因診斷技術，是一種快速、便攜、低成本的檢測方法，現已廣泛用于疾病檢測方面[14-16]，本研究在原有的 LAMP技術基礎上進行了一些改良，主要改良方面總結如下： 1)模板提取的改良。由于Bst酶的抗干擾能力比較好，因此可以將收集的臨床標本直接煮沸進行核酸的粗提，省去繁雜的核酸純化過程，使核酸提取步驟大大簡化。2)結果判定的改良。LAMP的結果判定常用濁度法，該方法單用肉眼難以判定結果，需要用濁度儀檢測才能確定擴增結果，判斷起來比較不便。本研究在擴增反應開始前向體系中加入鈣黃綠素，利用其顏色改變進行結果判定，使其即不抑制擴增，又可使結果可視化，使結果判定更加簡單。

本文中建立的 LAMP體系為 HPV的分型檢測提供了初步探索經驗，如果能在此基礎上對該技術進行進一步改良，如制作基于 LAMP技術的便攜式核酸擴增檢測儀或開發一步法封閉式檢測管，必將更有利于應用 LAMP技術在基層或現場進行檢測。