腎透明細胞癌超聲造影參數(shù)與腫瘤新生血管相關(guān)性研究

孟 夏，趙勝男，楊 冉，張秀娟，王 輝

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 超聲科，吉林 長春130033)

腎細胞癌是最常見的腎臟惡性腫瘤，其中70%是腎透明細胞癌(ccRCC)，ccRCC是最具有侵襲性的亞型[1]。腫瘤血管形成是多數(shù)人類腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[2]，ccRCC是高度血管化惡性腫瘤，微血管密度(MVD)和分化程度是預(yù)測病灶侵襲性的關(guān)鍵指標(biāo)[3]。但由于現(xiàn)階段缺乏無創(chuàng)性評價腫瘤新生血管MVD、分化程度的方法，無法無創(chuàng)、有效評估腫瘤惡性生物學(xué)行為，限制了非侵入性治療ccRCC的發(fā)展。超聲造影(CEUS)的微血管顯像技術(shù)使臟器實質(zhì)灌注和微循環(huán)實現(xiàn)可視化成為可能[4-5]。本研究通過免疫組化的方法確定腫瘤新生血管密度、分化程度，分析其與超聲造影的相關(guān)性，從而實現(xiàn)超聲造影無創(chuàng)性評價ccRCC的新生血管情況，促進無創(chuàng)性治療的進一步發(fā)展。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2019年10月吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院經(jīng)病理證實的78例ccRCC患者，術(shù)后切片行WHO/ISUP分級，其中Ⅰ-Ⅱ級52例，Ⅲ-Ⅳ級26例，均符合病理專業(yè)診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者超聲造影前均未經(jīng)藥物及手術(shù)治療，超聲檢查與手術(shù)治療時間間隔小于14天。其中男性36例，女性42例，年齡28-79歲，平均(55.56±10.90)歲。病灶直徑1.5-13.0 cm，平均(4.1±2.2)cm。納入研究患者除外標(biāo)準(zhǔn)：(1)ccRCC外混有腎細胞癌其他組織分型(2)CEUS視頻圖像質(zhì)量不能進行超聲造影參數(shù)定量分析(3)ccRCC腫瘤組織樣本不足以進行免疫組化(4)一側(cè)腎多個病灶,或雙腎病灶。(5)已發(fā)生轉(zhuǎn)移后經(jīng)全身治療患者。該研究已獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)，并在登記時獲得每位患者書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1超聲造影檢查及圖像分析 利用常規(guī)超聲與彩色多普勒選取顯示腫塊及周圍腎組織的最佳切面，進行CEUS檢查，使用Esaote MyLabTwice超聲診斷儀，探頭中心頻率3.5 MHz。超聲造影劑選用SonoVue，使用前注入生理鹽水5 ml，充分震蕩至乳白色液體后抽出1.5 ml，經(jīng)患者肘部淺靜脈團注，隨之用5 ml生理鹽水沖注。選擇最佳切面后在低機械指數(shù)狀態(tài)(MI 0.10)下進入超聲造影模式，同時啟動內(nèi)置錄像系統(tǒng)記錄CEUS全過程，造影劑注入完成后進行計時，在成像采集過程中，患者被要求屏氣，呼吸障礙患者被要求輕緩呼吸，如果可能的話長達30 s，以便實時動態(tài)地觀察造影劑動脈相、靜脈相(開始灌注至正常腎皮質(zhì)內(nèi)造影劑顯示最強時所持續(xù)的時間定為動脈相，之后定為靜脈相。動脈相提供了正常腎組織和病灶內(nèi)血管分布數(shù)量和形態(tài)迂曲程度，靜脈相提供了超聲造影劑在正常腎組織和病灶內(nèi)清除的信息[6-7])，持續(xù)觀察 3-5 min，再錄像、保存。

啟動Qontraxt軟件，動態(tài)回放觀察造影全過程，先畫出整個腎臟造影聲像圖，待整體參數(shù)成像出來后，分別勾畫兩個感興趣區(qū)域(ROI)ROI1、ROI2。ROI1是超聲圖像上ccRCC腫瘤邊緣最增強的部分，ROI2是腫瘤臨近正常腎皮質(zhì)。盡量保持ROI1、ROI2在大小和深度上一致。在描繪ROI時，盡量勾劃出腫塊中有造影劑充填的區(qū)域，排除掉沒有意義的強化缺失區(qū)、鈣化和腎被膜。測量進行多次，并計算平均值。繪制造影時間-強度曲線 (TIC)，記錄TIC參數(shù)指標(biāo)：(1)定量指標(biāo)：達峰時間(TP)、峰值強度(PI)(2)定性指標(biāo)：造影劑填充快慢、造影劑排出快慢(通過與臨近腎皮質(zhì)TIC上升支斜率對比評價填充快慢，通過與臨近腎皮質(zhì)TIC下降支斜率對比評價排出快慢)、增強均勻性(均勻性與否取決于圖像是否有充盈缺損)、腫瘤假包膜完整性。超聲造影及超聲造影軟件評估均由兩名有10年以上超聲經(jīng)驗的專家操作和解釋，他們對病人的所有信息包括病理診斷均不知情。

1.2.2MVD與新生血管分化程度的分析 78例腫瘤組織標(biāo)本蠟塊，各制備4 μm厚切片2張，組織學(xué)切片用蘇木精和伊紅染色(H&E)。免疫組化的染色方法分別用鼠抗人CD34單克隆抗體、鼠抗人CD31單克隆抗體(羅氏生物技術(shù)開發(fā)有限公司)標(biāo)記內(nèi)皮細胞。CD34 、CD31以腫瘤血管內(nèi)皮細胞膜表面出現(xiàn)棕黃色著色為陽性判斷，并按照 Weidner 法[8]進行定量。即每例標(biāo)本先于100 倍光鏡觀察，選擇陽性細胞聚集明顯較其他部位多的部位，可視為一個“熱點”，但因為本研究要評估每例患者兩個連續(xù)切片的CD31與CD34的差異性表達，所以要選擇CD31染色片中血管最豐富的區(qū)域來定義熱點。選擇5個MVD 最高的視野于200 倍光鏡下計算微血管數(shù)目，然后計算其平均值，得到ccRCC的平均MVD。因為CD31與CD34在分化與未分化血管上的表達異質(zhì)性[9]，可通過抗CD31抗體染色的血管數(shù)值減去抗CD34抗體染色的血管數(shù)，來獲得未分化血管在整個腎腫瘤中的比例(MVDcd31+/cd34-%=MVDcd31+-MVDcd34+/MVDcd31+)。中位數(shù)作為截斷點，將患者分為高MVD組和低MVD組。組織標(biāo)本的處理和分析由本醫(yī)院的病理學(xué)專家完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)表示，兩組間比較采用卡方檢驗。ccRCC超聲造影定量參數(shù)與微血管密度、分化程度相關(guān)性，采用Spearman直線相關(guān)分析，計算相關(guān)系數(shù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微血管高低表達組超聲造影定量參數(shù)對比

以中位數(shù)作為截斷點，將患者分為高MVD組和低MVD組(CD34+MVD中位數(shù)為60.5/HP，CD31+MVD中位數(shù)為63/HP，CD31+/CD34-MVD%中位數(shù)為12.5%)。與低表達組相比，CD34+MVD、CD31+MVD高表達組PI,TP均較高，CD31+/CD34-MVD%高表達組PI,TP均較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1，見圖1-2)。

表1 微血管高低表達組超聲造影定量參數(shù)對比(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

圖1 MVD低表達組超聲造影表現(xiàn) ①ccRCC腫瘤的常規(guī)和造影圖像；②ROI1(腫瘤邊緣增強最明顯部位)；③ROI2(ROI2是腫瘤臨近正常腎皮質(zhì))；④ROI1的TIC曲線；⑤ROI2的TIC曲線

圖2 MVD低表達組免疫組化結(jié)果(×100) ①CD34單克隆抗體標(biāo)記內(nèi)皮細胞；②CD31單克隆抗體標(biāo)記內(nèi)皮細胞，箭頭處為CD31+/CD34-(未分化血管)

2.2 ccRCC超聲造影定量參數(shù)與微血管密度、分化程度相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman直線相關(guān)分析，ccRCC超聲造影定量參數(shù)PI，TP與CD34+MVD，CD31+MVD成正相關(guān)，與CD31+/CD34-MVD%呈負相關(guān)(r>0，P<0.05)(見表2，見圖1-2)。

表2 ccRCC超聲定量參數(shù)與微血管相關(guān)性研究(相關(guān)系數(shù))

2.3 ccRCC超聲造影定性參數(shù)與微血管密度、分化程度相關(guān)性分析

與低表達組相比，CD34+MVD、CD31+MVD高表達組，超聲造影劑灌注模式主要表現(xiàn)為快進模式，CD31+/CD34-MVD%高表達組，超聲造影劑灌注模式主要表現(xiàn)為慢進，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。超聲造影增強均勻性、造影劑消退方式、假包膜完整性，在MVD高低表達組沒有明顯差異(見表3)。

表3 ccRCC超聲定性參數(shù)與微血管相關(guān)性研究(病例數(shù))

3 討論

CCRCC是最常見的腎臟惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高，手術(shù)治療是目前最有效的治療方法，但根治性腎切除手術(shù)嚴重影響患者生存質(zhì)量，部分切除術(shù)復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率均很高，5年生存率低，預(yù)后不良[10]。因此尋求非手術(shù)治療，尤其是對ccRCC效果較好的抗血管治療[11]尤為重要，如單克隆抗體貝伐珠單抗[12]等抗血管藥物的應(yīng)用越來越受到認可，但因缺乏非侵入性評估CCRCC腫瘤新生MVD、分化程度的方法，不能評估腫瘤的惡性生物學(xué)行為，限制了抗血管藥物的臨床應(yīng)用。CT、MRI雖然也可用于無創(chuàng)性評估，但由于輻射、腎毒性和金屬植入物等因素，它們的使用受到限制。本研究中我們利用超聲血管造影分析軟件定量、定性分析了78例患者超聲造影征象。通過免疫組化的實驗方法量化MVD，評價新生血管的分化水平，確定超聲造影參數(shù)與腫瘤新生血管相關(guān)性。

超聲造影定量參數(shù)PI為灌注峰值，與ROI內(nèi)的平均血容量呈正比。TP為病灶內(nèi)出現(xiàn)第1個造影劑微泡至到達灌注峰值的時間。TIC曲線的上升支斜率與下降支斜率，與組織灌注和清除的快速程度有關(guān)。與低表達組相比，CD34+MVD、CD31+MVD高表達組PI,TP均較高(P<0.05)，且CD34+MVD、CD31+MVD表達的高低與PI呈明顯正相關(guān)。CD34+MVD、CD31+MVD高表達組，超聲造影劑灌注模式主要表現(xiàn)為快進模式。研究表明，通過定性和定量超聲造影參數(shù)，可以有效的評價腫瘤內(nèi)部新生血管的MVD。

研究表明，ccRCC腫瘤內(nèi)部有分化型和未分化型兩種類型新生血管[13]。本研究利用CD31在兩種血管均有表達，CD34主要在分化血管表達這種差異性，利用免疫組化的方法，量化了ccRCC新生血管中的未分化血管(CD31+/CD34-)。在本研究中CD31+/CD34-MVD%高表達組PI,TP均較低(P<0.05)，超聲造影劑進入灌注模式主要表現(xiàn)為慢進的模式。周細胞覆蓋率是反映血管成熟的重要標(biāo)志，是抗血管治療的重要靶點[14-15]，CD34+(分化血管)的血管的周細胞覆蓋率高于CD31+/CD34-(未分化血管)的血管，所以未分化血管較分化血管更加不成熟。這些特點決定了未分化血管在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為沒有或管腔小，形態(tài)迂曲，故此時腫瘤內(nèi)血管的形態(tài)多為距離較寬的、輪廓缺失、迂曲嚴重的新生血管。所以未分化血管比例高時，出現(xiàn)了增強不明顯、造影劑在微血管網(wǎng)內(nèi)停留時間較短等乏血供特點，造影劑進入模式多表現(xiàn)為慢進的模式。綜上所述，超聲造影不僅可以有效的無創(chuàng)性評估新生血管MVD，還可以評估新生血管的分化程度，這對于抗血管治療等無創(chuàng)性治療的發(fā)展，具有重要意義。

本研究的不足之處在于，雖然對于免疫組化染色的質(zhì)量進行嚴格控制，選擇了抗CD31抗體染色較好的熱點，來計算未分化血管的數(shù)量，但這也可能使我們的MVD計數(shù)較其他文獻計數(shù)較低。此外，研究的樣本量較小，屬于回顧性研究，所以我們的研究只是初步研究。未來的研究應(yīng)該以前瞻性的方式進行，采用更大的隊列來進一步驗證我們的結(jié)果。

綜上所述，應(yīng)用超聲造影參數(shù)定量和定性分析可以間接的反應(yīng)ccRCC的新生血管微血管密度、分化程度，能夠客觀的反應(yīng)腫瘤的惡性生物學(xué)行為，對于ccRCC的非侵入性治療的發(fā)展具有重要的意義。