孕中期高危孕婦外周血中胎兒游離DNA與高危產(chǎn)前診斷指征相關(guān)性分析

趙詠梅，張傳英，席海林

(四川省遂寧市中心醫(yī)院 產(chǎn)前診斷實驗室，四川 遂寧629000)

數(shù)據(jù)報道，我國出生缺陷發(fā)生率約為4%-6%，是出生缺陷大國[1]。其中染色體異常所造成的出生缺陷是我國常見的嚴重出生缺陷之一，及時參加產(chǎn)前診斷是阻斷出生缺陷發(fā)生的關(guān)鍵[2]。無創(chuàng)產(chǎn)前篩查簡便、可行、無創(chuàng)，即對發(fā)病率高、病情嚴重的遺傳性疾病或先天畸形進行篩查，對檢出子代具有出生缺陷的高風險人群再進行進一步確診是我國目前預(yù)防出生缺陷的重要手段[3-4]。早期有研究報道，孕5周后胎兒DNA便能釋放至母體內(nèi)，并在出生后2 h內(nèi)清除，這也是臨床利用胎兒游離DNA(cffDNA)進行產(chǎn)前篩查的基礎(chǔ)[5]。如李燕芳等[6]應(yīng)用cffDNA檢測21、18、13三體綜合征也取得滿意獲益。本研究對孕中期高危孕婦進行cffDNA檢測，并分析其與高危產(chǎn)前診斷指征相關(guān)性，以期為孕中期高危孕婦的產(chǎn)前篩查和診斷提供參考依據(jù)，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年7月-2019年7月在遂寧市中心醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心接受外周血cffDNA篩查的3176例孕中期高危孕婦，年齡21-45歲；篩查者均符合《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范(2016)》[7]中孕婦外周血cffDNA檢測適用范圍。包括血清學篩查為臨界風險者(篩查風險值在1/1000≤T21風險值<1/270)；高齡(年齡≥35歲)；合并介入性產(chǎn)前診斷禁忌癥者；孕20+6周以上錯過血清學篩查時間，但要求評估21、18、13三體綜合征風險者；夫婦一方有明確染色體異常；胎兒超聲檢查顯示軟指標或結(jié)構(gòu)異常者等。具有上述檢測指征的孕婦在充分知情同意情況下選擇外周血cffDNA產(chǎn)前篩查。

1.2 方法

cffDNA檢測：采集孕婦10 ml外周血，置于cell free DNA BCT采血管，顛倒混勻后低溫(4℃-8℃)保存待檢。將采集管4℃、1 600 g條件下離心10 min，吸取上清液，16 000 g離心10 min，留取上層血漿；應(yīng)用磁珠法對分離好的血漿樣品進行游離DNA提取；Qubit定量分析儀檢測血漿cffDNA濃度。應(yīng)用可逆末端終止測序法構(gòu)建測序文庫，針對cffDNA將下片段DNA末端補平，再與測序通用引物進行接頭對接；應(yīng)用貝瑞和康高通量測序文庫構(gòu)建DNA純化試劑盒對文庫構(gòu)建產(chǎn)物進行純化，Stepone QPCR儀對純化后的DNA文庫進行定量檢測。NextSeq CN500基因測序儀、參照儀器標準操作規(guī)程對構(gòu)建成功的文庫進行檢測，將上機測物所得數(shù)據(jù)上傳至貝比安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)與人類基因組序列進行對比分析，參照Denis Lo計算方法獲得Z值。Z值代表計算每條染色體所占比例的評分結(jié)果，Z值>3.0樣本判定為該染色體三體，<-3.0則提示該染色體單體高危，-3

染色體核型分析：對cffDNA檢查高風險的孕婦，經(jīng)孕婦知情同意后開展超聲引導下羊膜腔穿刺，采集20ml羊水常規(guī)離心去上清液，保留0.5 ml，與4.5 ml羊水培養(yǎng)基混合后接種于25ml無菌培養(yǎng)管后獨立培養(yǎng)箱培養(yǎng)(5%CO2、37℃)，8-10 d后常規(guī)制片、烤片、G顯帶并參照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN，2016)對核型分析結(jié)果進行描述。

1.3 統(tǒng)計學分析

SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用n(%)描述，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 孕中期高危孕婦產(chǎn)前診斷指征分布3176例孕中期高危孕婦的產(chǎn)前診斷指征分別：高齡(年齡≥35歲)33.63%(1068/3176)、血清學篩查臨界風險994/3176(31.30%)、血清學篩查高風險18.29%(581/3176)、不良孕產(chǎn)史2.90%(92/3176)、B超軟指標異常2.39%(76/3176)、B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常0.22%(7/3176)、其他11.30%(359/3176)，見圖1。

圖1 高危產(chǎn)前診斷指征分布

2.2 孕中期高危孕婦的cffDNA檢測結(jié)果3176例孕中期高危孕婦cffDNA檢查結(jié)果顯示，57(1.79%)例孕婦外周血cffDNA檢查結(jié)果為高風險，21三體占40.35%，性染色體非整倍體(sex chromosome abnormalities,SCA)其次，見表1。

表1 孕中期高危孕婦的cffDNA檢測結(jié)果(n，%)

2.3 孕中期高危孕婦外周血中cffDNA與高危產(chǎn)前診斷指征的相關(guān)性B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦外周血cffDNA檢測高風險相對比例最高，為28.57%，其次為血清學篩查高風險(2.75%)、不良孕產(chǎn)史(2.17%)、高齡(1.97%)、 血清學篩查臨界風險(1.21%)、其他(1.12%)，見表2。

表2 孕中期高危孕婦外周血中cffDNA與高危產(chǎn)前診斷指征的相關(guān)性(n，%)

2.4 cff-DNA產(chǎn)前篩查高風險對胎兒染色體異常的準確性分析57例孕婦外周血cffDNA高風險患者中，染色體核型分析染色體核型異常32例，cffDNA高風險預(yù)測21三體的準確率最高，為82.60%，其次為18三體、SCA，見表3。

表3 cff-DNA產(chǎn)前篩查高風險對胎兒染色體異常的準確性分析

3 討論

據(jù)相關(guān)資料顯示，我國新生兒出生缺陷概率為5.6%，降低出生缺陷倍受社會多方關(guān)注。早中期產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷更具有臨床意義。尤其是孕中期高風險孕婦，要面對創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的壓力，部分孕婦甚至因此拒絕接受產(chǎn)前診斷，這也是羊水穿刺產(chǎn)前診斷接受率低的主要原因之一，從而導致病例漏診[8-9]。而母體血漿cffDNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查染色體非整倍體作為相對理想、且對胎兒無風險的產(chǎn)前檢查途徑，無疑為孕中期高危孕婦的產(chǎn)前檢查提供了新途徑，對降低出生缺陷、提高優(yōu)生優(yōu)育率有重要價值[10]。但孕婦外周血cffDNA含量受孕婦體重、孕周等因素影響，存在cffDNA檢查誤診或漏診現(xiàn)象。如張玢等[11]報道孕婦外周血cffDNA無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)檢測失敗率為0.088%，這說明cffDNA檢查也存在局限性，需與其他相關(guān)產(chǎn)前檢查手段聯(lián)合診斷。

當前研究所報道的外周血cffDNA主要側(cè)重于與產(chǎn)前介入診斷結(jié)果的比較，而分析孕中期高危孕婦外周血中cffDNA與高危產(chǎn)前診斷指征相關(guān)性的報道較少，因此，本研究回顧性分析3176例孕中期高危孕婦的產(chǎn)前篩查資料，著重探究孕中期高危孕婦外周血中cffDNA與高危產(chǎn)前診斷指征相關(guān)性。本研究顯示，3176例孕中期高危孕婦的產(chǎn)前診斷指征主要為高齡(年齡≥35歲)33.63%、血清學篩查臨界風險31.30%、血清學篩查高風險18.29%。其中高齡(年齡≥35歲)比例較高的原因可能與近年國家全面二胎政策的開放有關(guān)。血清學篩查人群僅次于高齡，這與國內(nèi)開展孕婦外周血cffDNA檢測的首要指征是血清學篩查臨界風險有關(guān)[12-13]。cffDNA檢查結(jié)果顯示1.79%的孕婦外周血cffDNA檢查結(jié)果為高風險，其中以B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦外周血cffDNA檢測高風險相對比例最高，為28.57%。由此可見，對B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常、外周血cffDNA檢測高風險孕婦或應(yīng)盡可能接受介入性產(chǎn)前診斷，并可依據(jù)具體情況考慮是否進一步接受其他相關(guān)產(chǎn)前診斷技術(shù)檢查[14]。B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕中期高危孕婦外周血中cffDNA篩查高風險比例需引起重視。謝佐蓮等[15]也報道相似，孕婦外周血cffDNA檢測技術(shù)可作為產(chǎn)前篩查的有效輔助手段，但基于cffDNA檢查技術(shù)對性染色體非整倍體異常的陽性預(yù)測值較低這一局限性，當cffDNA檢測為高風險時，一定要與相關(guān)產(chǎn)前診斷技術(shù)來驗證[16]。本研究進一步與染色體核型分析結(jié)果比較，結(jié)果顯示57例孕婦外周血cffDNA高風險患者中，染色體核型分析染色體核型異常臨床為56.14%，cffDNA高風險預(yù)測21三體的準確率最高，為82.60%，其次為18三體、SCA。由此也可見，具高危產(chǎn)前診斷指征的孕婦開展cffDNA監(jiān)測十分必要，對cffDNA高風險群體進一步開展染色體核型分析于優(yōu)生優(yōu)育有益。