枸杞多糖通過 TGFβ1/ Smad3信號通路改善慢性心衰大鼠心肌纖維化

孟立立

(北部戰區總醫院 先心病科，遼寧 沈陽110016)

心力衰竭(heart failure,HF)是多種循環科疾病的終末階段，臨床表現為心室收縮和(或)舒張功能障礙，導致體循環瘀血、肺靜脈瘀血以及多臟器灌注不足，引起的以循環障礙為主的癥候群[1]。目前全球心力衰竭患者約2250萬，其中我國心力衰竭患者比重較大，發病率約為0.9%-1.4%，且呈逐年增長趨勢。因此有效針對其發病機制予以防治具有重要意義[2]。目前已知心室重構(ventricular remodeling,VR) 是CHF發生發展的主要病理變化，即心室肌細胞的纖維樣改變，導致心室肌僵硬度增加，引起心室收射血功能障礙[3]。近年來研究發現枸杞子提取物——枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide LBP)具有抑制氧化應激、抗炎癥反應、抑制腫瘤生長、調節糖脂代謝等多種生物活性。研究發現，LBP對鹽酸異丙腎上腺素(IOS)導致的CHF大鼠心功能具有保護作用，但其作用機制有待證實，TGF-β是調節細胞生長、分化、凋亡的重要細胞因子，對細胞損傷和修復、免疫功能等具有重要作用[4]。目前已證實，TGF-β1 通路在心肌梗死后心肌細胞損傷修復及重構過程中發揮重要作用，Smads蛋白是 TGF-β1信號通路重要的下游調節因子，TGF-β1與其受體結合后磷酸化并激活Smads蛋白，后者可以發揮轉錄因子功能，調節相關細胞因子的基因表達，最終誘導纖維化[5]。本研究以慢性心力衰竭大鼠為研究對象，觀察枸杞多糖對其心臟功能的改善作用，初步探討TGFβ1/ Smad3 通路在其中的調控機制，為臨床心力衰竭防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取SPF 級雄性 SD 大鼠30只， 體質量250-300 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供(生產許可證號：SCXK(遼)-2013-0001，使用許可證號：SYXK(遼)-2013-0007)，實驗動物在符合相應資質與條件設施中飼養，以便充足食水供應并確保自由取食，光照等環境條件模擬自然情況。根據中國醫科大學實驗動物管理委員會要求，所有實驗動物均需適應性飼養7天，構建CHF大鼠動物模型應用腹主動脈縮窄法，將模型構建成功的CHF大鼠隨機分為心力衰竭模型組(CHF組，n=10)、枸杞多糖+心力衰竭模型組(LBP組，n=10)，另構建假手術組(sham組，n=10)。

1.2 慢性心力衰竭大鼠模型制備[6]

大鼠腹腔注射麻醉后，密切關注大鼠生命體征變化，避免麻醉過深引起呼吸抑制而死亡。將大鼠胸腹部備皮后仰臥位固定于無菌小動物手術臺，常規連接監護儀，待大鼠生命體征平穩后術區消毒，左上腹縱行切開皮膚，逐層剝離肌層，充分暴露雙腎及腹主動脈，應用27G注射針頭將雙腎動脈遠端約0.5 cm處與腹主動脈一同結扎，待拔出注射針頭后，可實現主動脈狹窄約55%-60%，全程監測生命體征，最后逐層閉合腹腔。sham組大鼠區別在于暴露腹主動脈后不予以結扎。盡量保證在相同實驗條件下建模，確保組間均衡。成功實驗動物建模后予枸杞多糖溶液灌胃，枸杞多糖溶液滴定濃度為100 mg·kg-1，將該實驗組歸為枸杞多糖+心力衰竭模型組(LBP 組)，單純心力衰竭模型組(CHF組)及假手術組(sham組)以同等劑量蒸餾水灌胃，各組持續給藥時間8周。

1.3 超聲心動圖檢查

枸杞多糖加心力衰竭模型組(LBP 組)、心力衰竭模型組(CHF組)及假手術組(sham組)實驗動物藥物干預處理結束后，采用乙醚吸入麻醉方式將實驗動物麻醉，充分暴露大鼠胸部，超聲心動儀選用飛利浦公司CX-50，探頭型號為S-12-4，頻率4-12 MHz。測定左心室舒張期末徑(left ventricular internal dimension diastole LVDD)、左心室收縮期末徑(left ventricular internal dimension systole LVDS)、左心室射血分數(Left ventricular ejection fraction LVEF)、左心室短軸縮短分數(Left ventricular short axis shortening fraction LVFS)。超聲均由具有操作資質同一單人實施，各實驗組測量結果連續測量3個心動周期，取平均值。

1.4 心臟標本采集與檢測

各實驗組在體干預及相關檢查結束后處死大鼠，解剖并暴露心臟，通過右心耳入路，左心室注射預冷生理鹽水灌流后，剝離心臟，擦干多余水份，剝離全心、右心室及左心室，分析天平分別稱取質量并計算右心指數(right ventricular mass index，RVMI) 及左心指數(left ventricular mass index,LVMI)，最后取部分左心室心肌組織采用中性福爾馬林溶液固定，部分置于-80℃冰箱中保存用于病理學實驗以及免疫組化、免疫印記等進一步分子生物學實驗。

1.4.1HE染色 取福爾馬林溶液固定后的左室心肌組織，PBS溶液沖洗后，經梯度酒精脫水，透明、包埋、切片，貼片，烤片等常規程序，分別蘇木精染色5分鐘，1%鹽酸酒精分色5 s，氨水沖洗反藍1 min，蒸餾水沖洗30 s，經伊紅染液30 s，PBS溶液沖洗后，封片光鏡下觀察。

1.4.2Masson染色 心臟組織脫蠟、脫水后置于Regaud蘇木素液染5 min；梯度酒精脫水等流程封片，行光鏡觀察。

1.4.3Western blot 裂解心肌組織，勻漿，離心取上清，蛋白定量，行電泳、轉膜，加入抗TGF-β1、 Smad3、p-Smad3、膠原蛋白 I、膠原蛋白 Ⅲ一抗，4℃冰箱中孵育過夜，加二抗，孵育。蛋白條帶行吸灰度分析。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 心臟超聲檢查

超聲心動圖是臨床上評價心臟功能及結構改變的常用方法，本研究收集各組大鼠心臟功能及結構參數來評價枸杞多糖對CHF大鼠心功能的調節作用，結果如圖1所示，與sham組相比，CHF組LVDD、LVDS顯著升高(P<0.05)，LVEF、LVFS顯著降低(P<0.05)，提示CHF大鼠模型構建成功。經枸杞多糖干預后，心衰大鼠LVDD、LVDS顯著降低(P<0.05)，LVEF、LVFS顯著升高(P<0.05)，差異具有統計學意義，說明LBP可以改善CHF介導心臟功能障礙。

圖1 各組大鼠 LVDD、LVDS、LVEF及LVFS 結果

2.2 LVMI及RVMI情況

RVMI、LVMI是評價心臟心室結構改變的重要手段，本研究稱取各組大鼠全心、左室及右室質量，并計算各組大鼠RVMI及LVMI來評價各組大鼠心室重構現象，結果如圖2所示，與sham組相比，CHF組RVMI、 LVMI均顯著升高(P<0.05)，枸杞多糖可以顯著降低RVMI、LVMI(P<0.05)，差異均具有統計學意義，這一結果與超聲結果一致，均提示LBP可以明顯改善CHF介導的心室重構。

圖2 各組大鼠LVMI及RVMI結果

2.3 HE染色

HE染色觀察心肌組織可見sham組大鼠細胞排列有序、規則，結構完整，未見明顯細胞損傷；CHF組大鼠細胞腫脹，細胞邊界模糊不清，心肌細胞損傷嚴重，與 CHF組相比，LBP組大鼠心肌細胞損傷程度明顯改善。以上結果提示LBP可改善CHF誘導的心肌細胞損傷，見圖3。

圖3 HE染色結果(×200)

2.4 Masson染色

心機膠原蛋白沉積是導致心室僵硬度增加的主要病理因素，我們采用Masson染色觀察各組大鼠心室肌纖維化程度，結果提示CHF組大鼠心肌組織中大量膠原纖維蛋白沉積，心肌纖維化程度較重；經LBP干預后，大鼠心肌組織中僅見少量膠原纖維蛋白沉積，纖維化程度較CHF組明顯減輕，提示LBP可顯著改善CHF大鼠心室肌纖維化程度，見圖4。

圖4 Masson染色結果(×200)

2.5 Western blot

TGF-β1/Smads信號通路是重要的纖維化調節因子，既往研究表明，TGF-β1/Smads通路激活會促進膠原纖維蛋白的沉積，參與心室重構的進展[17]。為明確枸杞多糖對CHF大鼠的調控機制，我們利用Western blot檢測心肌組織中TGF-β1、Smad3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表達，結果與sham組相比，CHF組大鼠心肌組織中TGF-β1、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ 表達均顯著升高(P<0.05)，Smad3磷酸化水平增強，而枸杞多糖可以顯著下調TGF-β1、collagen I和collagen Ⅲ 表達，抑制Smad3磷酸化水平(P<0.05)，提示LBP能夠改善CHF大鼠心功能，抑制心室重構進展，,其作用機制可能與抑制TGF-β1/Smads通路活性有關。

3 討論

心力衰竭常發生于心血管疾病的終末期，可導致嚴重的循環功能障礙(circulatory dysfunction PICD)，異常的容量及壓力負荷可導致心室結構及心肌順應性改變，進而引起心臟射血功能及舒張功能障礙、心排血量減少，機體組織及細胞代謝功能紊亂。因此，預防VR的病理進展、提高心臟射血及舒張功能是改善HF患者遠期預后的重要途徑。本實驗以壓力負荷型CHF大鼠為研究對象，探討枸杞多糖的調控作用，結果表明，LBP可顯著改善CHF大鼠心肌纖維化進展，提高大鼠心功能，改善心肌細胞損傷，其作用機制可能與抑制心肌膠原蛋白沉積、抑制TGF-β1/Smads信號通路有關。

枸杞多糖作為枸杞子中的有效成分，具有清除自由基、增強氧化酶活性、減少氧化應激反應、提高機體抗氧化能力等功能[7]。有研究證實，在缺血缺氧條件下，LBP對心肌細胞損傷具有同樣的保護作用。Lu等人以心肌缺血再灌注損傷(IR)大鼠為研究對象，觀察LBP對大鼠心肌細胞損傷的影響，結果發現LBP可以顯著降低IR大鼠心肌LD水平，提高Na+-K+- ATP酶和Ca2+- ATP酶活性，此外，LBP可顯著下調Bax水平，抑制細胞凋亡，并呈劑量依賴性增加Bcl-2表達水平[8]。劉新巖等人利用LBP干預IOS誘導的CHF大鼠，結果發現，LBP可抑制CHF大鼠心肌纖維化進展[9]。由此可見，枸杞多糖對心血管疾病的發生發展有一定的預防作用。本研以CHF大鼠為研究對象，并予以LBP干預，結果發現LBP可顯著改善CHF大鼠心臟收縮及舒張功能，減輕心肌細胞損傷，同時抑改善心室結構改變及心肌纖維化進展，推測LBP可以抑制大鼠心室重構進展并發揮心肌保護作用。

圖5 各組大鼠心臟凋亡相關蛋白表達水平檢測結果

細胞外基質的過量沉積、膠原纖維異常增生以及各型膠原比例失調是加速心室重構進展的重要病理機制之一[10-11]。膠原纖維維持心肌結構及功能的主要骨架，其主要包括Ⅰ型和Ⅲ型兩種結構[12]。當纖維蛋白合成與降解平衡被打破后，膠原纖維化蛋白逐漸累積，室壁硬度增加、心室順應性改變，進而導致心臟功能受損[13]。既往研究發現，心梗發生后，以Ⅰ型和Ⅲ型為主的膠原蛋白過量沉積，加速VR的進展，是導致心肌梗死后心功能改變的主要病理因素。CHEN等研究發現，慢性心力衰竭大鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白過量表達與心功能改變呈負相關[14]。因此，有效清除過量的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白沉積，是逆轉VR的關鍵。本研究發現CHF大鼠心肌組織中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達明顯增高，這與上述研究結果一致，說明collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白異常沉積是導致心室硬度增加、引起心肌纖維化的主要原因，而LBP可顯著下調CHF大鼠心肌組織中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達，這與上述研究結果一致，均提示LBP對心衰大鼠心功能的改善作用可能與其抑制心肌組織中Ⅰ型和 Ⅲ 型膠原蛋白異常過量沉積有關。

TGF-β1作為重要的促纖維化細胞因子,主要參與調節成纖維細胞的增殖、轉化、遷移、凋亡以及以膠原蛋白為主的細胞外基質的合成,同時具有誘導心肌成纖維細胞分化為有更強組織連接功能的肌成纖維細胞，促進心肌細胞纖維化進展。Smads蛋白是TGF-β1的下游信號分子,是唯一可以與TGF-β1結合的底物[15]，既往研究證實TGF-β1/Smads通路的激活在促進VR進展中發揮重要作用[16]。本研究發現CHF大鼠心肌組織中TGF-β1蛋白表達及Smad3磷酸化水平均顯著升高，既往研究表明，TGF-β1通路的激活，可促進Ⅰ型和Ⅲ型纖維膠原蛋白的合成，同時增強氧化應激反應、加重細胞凋亡，共同引起心肌功能障礙[17]。這與本研究CHF大鼠心肌組織中collagen I和collagen Ⅲ蛋白高表達結果一致。同時，本研究發現LBP可顯著下調TGF-β1表達，并抑制Smad3磷酸化，以上結果表明，LBP能夠改善CHF大鼠心功能，抑制心肌細胞損傷,其具體機制可能與下調TGF-β1/Smads通路活性進而減少心肌組織纖維蛋白沉積、最終抑制心肌纖維化有關。