MiR-144-3p對口腔鱗癌Cal27細胞增殖、侵襲、凋亡和PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響

李玉蘭，陳曉霞，魏天祥

(陜西省康復醫院 口腔科,陜西 西安710065)

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類短小的內源性非編碼RNA，可通過與靶mRNA的3’非編碼區(UTR)結合抑制mRNA的翻譯；部分miRNAs被證實在口腔鱗癌組織或細胞中異常表達，與口腔鱗癌的發生和轉移密切相關，可作為早期檢測的潛在生物標志物和潛在治療靶點[1-3]。miR-144-3p與腫瘤發生、發展關系密切。研究顯示，前列腺癌、胃癌和腎癌等腫瘤組織或細胞中miR-144-3p表達降低，過表達miR-144-3p通過誘導細胞凋亡和周期阻滯、抑制上皮間充質轉化具有抗腫瘤作用[4-6]。口腔鱗癌組織中miR-144-3p異常高表達，且與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和生存率有關[7]；然而，miR-144-3p在口腔鱗癌發生發展中的作用并不清楚。本研究通過常規生物學手段觀察miR-144-3p對口腔鱗癌CAL27細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并探討其可能的分子機制，以揭示miR-144-3p在口腔鱗癌中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器RPMI-1640培養基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗和二甲基亞砜(美國Gibco)，Trizol試劑、lipofectamineTM2000(美國Invitrogen)，miR-144-3p 模擬物(mimics)、miR-144-3p 抑制劑(inhibitor)及其相應的陰性對照(negative control，NC)mimics-NC、inhibitor-NC(廣州銳博生物)，Matrigel膠和噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)試劑(美國Sigma)，兔抗人第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)AKT和磷酸化AKT(p-AKT)多克隆抗體(美國Abgent)，兔抗人磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)單克隆抗體和鼠抗人β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國Abcam)，辣根過氧化酶標記的羊抗兔/鼠二抗(美國Thermo)。蛋白濃度檢測試劑盒(北京索萊寶)，蛋白提取試劑盒和miRNA反轉錄試劑盒(美國Thermo scientific)，膜聯蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡檢測試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天)。CO2細胞培養箱(美國ThermoFisher)，逆轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)儀(日本TaKaRa),全自動化酶標儀(美國Bio-Rad)，流式細胞分析儀(美國BD)，凝膠成像分析系統(美國UVP)。

1.2 細胞來源及其培養人口腔鱗癌CAL27細胞購于中科院上海細胞庫。使用添加100 ml/L胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養基在飽和濕度、37℃、5%CO2細胞培養箱中常規培養CAL27細胞。待細胞貼壁80%左右時，加入0.25%胰蛋白酶消化，并以1∶3比例傳代。實驗所有細胞為生長良好的第3代對數生長期細胞。

1.3 實驗分組與轉染實驗分為NC-mimics組(轉染mimics-NC)、miR-144-3p mimics組(轉染miR-144-3p mimics)、NC-inhibitor組(轉染inhibitor-NC)和miR-144-3p inhibitor組(轉染miR-144-3p inhibitor組)。將對數生長期的CAL27細胞以每孔250000個細胞接種至6孔細胞板上，置于細胞培養箱內常規培養。待細胞匯合度達75%左右時，參照轉染試劑lipofectamineTM2000說明書步驟根據實驗分組將miR-144-3p mimics、miR-144-3p inhibitor及其相應的mimics-NC、inhibitor-NC轉染至CAL27細胞中；分別將miR-144-3p inhibitor 與si-con，miR-144-3p inhibitor 與si-PTEN共轉染至CAL27細胞中，分別記作miR-144-3p inhibitor加si-con組、miR-144-3p inhibitor加si-PTEN組。每組設置3個復孔。轉染5 h后更換新鮮培養基，繼續培養48 h后胰酶消化收集各組細胞，采用RT-PCR檢測細胞中miR-144-3p的表達以評價轉染效果。

1.4 miR-144-3p表達的檢測采用RT-PCR檢測。運用Trizol試劑提取CAL27細胞中總RNA后，采用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度。參照miRNA反轉錄試劑盒說明書將RNA進行逆轉錄后，將1 μl逆轉錄產物cDNA與10 μl 2×SYBR Premix、各0.5 μl上下游引物及8 μl ddH2O2混合，制成20 μl PCR反應體系。PCR反應條件：94℃ 預變性3 min；94℃ 變性15 min、60℃ 退火 30 s、72℃ 延伸30 s，循環40次。以U6為內參，2-△△CT法計算CAL27細胞中miR-144-3p的表達水平。其中，miR-144-3p和U6引物參照文獻[7]。實驗重復3次。

1.5 細胞增殖能力的檢測采用MTT法檢測。分別收集轉染48 h的NC-mimics組、miR-144-3p mimics組、NC-inhibitor組和miR-144-3p inhibitor組細胞，以每孔10000個接種至96孔細胞板上，每組設置3次重復。置于細胞培養箱內分別培養48 h、72 h和96 h后，棄培養液，每孔加入濃度為5 g/L MTT試劑 20 μl。孵育4 h后，再向每孔中加入150 μl二甲基亞砜溶液震蕩至MTT結晶溶解。采用全自動化酶標儀在490 nm波長處檢測各組細胞的光密度值(OD值)。實驗重復3次。

1.6 細胞侵襲能力檢測采用Transwell小室檢測。將Transwell小室放入24孔細胞板中，在小室聚碳酸酯膜上鋪一層濃度為1 mg/ml Matrigel基質膠，常溫下充分聚合。取胰酶消化收集轉染48 h后的各組細胞懸液100 μl(含1000個細胞)加入到小室上層中，每組設3個重復，并在下層中加入600 μl含血清的培養基。置于細胞培養箱內孵育24 h后，取出小室，輕輕拭去上層內殘留的細胞，分別以4%多聚甲醛和0.5%結晶紫固定、染色。洗去染色液后，晾干。采用顯微鏡觀察統計各組中的穿膜細數，結果以隨機選取的3個視野內細胞數的均值表示。實驗重復3次。

1.7 細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測。使用預冷的磷酸緩沖液將收集轉染48 h后的各組CAL27細胞漂洗2次后，加入300 μl結合緩沖液調整細胞濃度。取細胞懸液100 μl(含10000個細胞)，依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混勻后避光孵育15 min。補加200 μl上樣緩沖液后，1 h內上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.8 PTEN/PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的檢測采用Western blot檢測。胰酶消化收集轉染48 h后的各組CAL27細胞，參照蛋白提取試劑盒說明書提取CAL27細胞總蛋白，并參照蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測總蛋白的濃度。將熱變性的蛋白樣品以每孔20 μl上樣至SDS-PAGE凝膠中行電泳分離。轉膜后，以5%脫脂奶粉的封閉液封膜2 h后，以PTEN(1∶1000)、PI3K(1∶300)、AKT(1∶200)、p-AKT(1∶200)和β-actin(1∶1000)一抗在4℃下孵育24 h后，再以辣根過氧化酶標記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h。經化學發光液暗室內顯影后，以β-actin為內參，采用凝膠成像分析系統分析各組細胞中PTEN、PI3K和AKT的磷酸化水平。實驗重復3次。

1.9 miR-144-3p與PTEN靶向關系的驗證使用生物信息學軟件Targetscan預測到PTEN 3’UTR與miR-144-3p存在互補的結合位點。為了驗證miR-144-3p與PTEN是否存在靶向關系，通過將PTEN的3′UTR 片段克隆到pmirGLO質粒上，構建野生型PTEN-WT 報告基因質粒，并利用Takara點突變試劑盒突變PTEN 3′UTR 上 miR-144-3p 結合位點后克隆至pmirGLO 質 粒 上，構建突變型PTEN-MUT質粒。將構建的PTEN-WT、PTEN-MUT質粒按照Lipofectamine TM2000說明書分別與NC-mimics、miR-144-3p mimics、miR-144-3p inhibitor、NC-inhibitor共轉染至CAL27細胞中，每個處理設置3個復孔。轉染48 h后，胰酶消化收集各處理組細胞，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測細胞的熒光素酶活性。實驗重復3次。

2 結果

2.1 miR-144-3p對Cal27細胞增殖的影響RT-PCR檢測NC-mimics組、miR-144-3p mimics組、NC-inhibitor組和 miR-144-3p inhibitor組細胞中miR-144-3p的表達水平分別為1.00±0.00、4.76±0.48、0.92±0.09和0.23±0.02，4組中miR-144-3p的表達水平存在明顯差異(F=608.431,P=0.000<0.05)。與NC-mimics組相比，轉染miR-144-3p mimics后CAL27細胞中miR-144-3p的表達水平明顯升高(4.76±0.48 vs 1.00±0.00，*P<0.05)；與NC-inhibitor組相比，轉染miR-144-3p inhibitor后CAL27細胞中miR-144-3p 的表達水平明顯降低(P<0.05)。不同組間、不同時間點間、組間×時間交互作用下的細胞活力(OD490)差異均有統計學意義(P<0.05)；轉染48 h、72 h和96 h后miR-144-3p mimics組細胞的增殖活力相對于NC-mimics組明顯升高(P<0.05)，而miR-144-3p inhibitor組細胞的增殖活力相對于NC-inhibitor明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 轉染miR-144-3p模擬物或抑制物對Cal27細胞活力的影響

2.2 miR-144-3p對Cal27細胞侵襲的影響與NC-mimics組相比，miR-144-3p mimics組細胞侵襲能力明顯增強(P<0.05)；而miR-144-3p inhibitor組細胞的侵襲能力較NC-inhibitor組明顯減弱(P<0.05)，見圖1和表2。

圖1 Transwell檢測轉染miR-144-3p模擬物或抑制物細胞侵襲

表2 轉染miR-144-3p模擬物或抑制物細胞侵襲能力的比較

2.3 miR-144-3p對Cal27細胞凋亡的影響與NC-mimics組相比，miR-144-3p mimics組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與NC-inhibitor組相比，miR-144-3p inhibitor組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 流式細胞儀檢測轉染miR-144-3p模擬物或抑制物細胞凋亡

表3 轉染miR-144-3p模擬物或抑制物細胞凋亡能力的比較

2.4 miR-144-3p與PTEN靶向關系的驗證運用Targetscan靶基因預測軟件得到PTEN 3' UTR與miR-144-3p存在互補結合位點。見表4。與NC-mimics組相比，miR-144-3p mimics使轉染PTEN-WT質粒細胞的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)；與NC-inhibitor組相比，miR-144-3p inhibitor可使轉染PTEN-WT質粒細胞的熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)；但miR-144-3p對轉染PTEN-MUT質粒細胞的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，見表5。

表4 PTEN 3′ UTR與miR-144-3p互補結合位點

表5 轉染miR-144-3p模擬物或抑制物細胞熒光素酶活性的比較

2.5 miR-144-3p對Cal27細胞中PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響與NC-mimics組相比，miR-144-3p mimics組細胞中PTEN蛋白的表達水平明顯降低，而PI3K蛋白的表達水平和AKT磷酸化水平明顯升高(P<0.05)；miR-144-3p inhibitor組細胞中PTEN蛋白的表達水平較NC-inhibitor組明顯升高，而PI3K蛋白的表達水平和AKT磷酸化水平較NC-inhibitor組明顯降低(P<0.05)，見圖3和表6。

圖3 Western blot檢測PTEN、PI3K蛋白和AKT磷酸化水平

表6 轉染miR-144-3p模擬物或抑制物細胞中PTEN、PI3K蛋白和AKT磷酸化水平的比較

2.6 沉默PTEN部分逆轉干擾miR-144-3p 對Cal27細胞的影響

與miR-144-3p inhibitor+si-con組比較，miR-144-3p inhibitor+si-PTEN組細胞活力顯著升高(P<0.05)，侵襲細胞數顯著增加(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，PTEN蛋白水平顯著降低(P<0.05)，PI3K、p-AKT蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、表7。

圖4 Western blot檢測共轉染miR-144-3p inhibitor 和si-PTEN細胞PTEN、PI3K蛋白和AKT磷酸化水平

表7 共轉染干擾miR-144-3p和沉默PTEN對Cal27細胞增殖、遷移和凋亡的影響

3 討論

口腔鱗癌是口腔癌的主要病理類型，具有易轉移、手術切除困難和術后易復發等特點。盡管放化療和修復重建技術使口腔鱗癌患者的治療效果明顯改善，但中晚期患者的生存率并不理想[8-9]。目前認為，口腔鱗癌的發生與人乳頭瘤樣病毒、吸煙、喝酒和咀嚼檳榔等因素有關，但其發生發展的分子生物學機制并不明確。研究[10-12]顯示，miRNAs可通過調控相關基因的表達、細胞增殖和轉移等參與口腔鱗癌的發生與發展。隨著研究的不斷深入，越來越多的miRNAs如miR-655、miR-545和miR-199a-5p等在口腔鱗癌中的作用被揭示[13-15]，但還有部分miRNAs的作用尚不清楚。

miR-144-3p是近年來發現的一種與腫瘤發生發展關系密切的miRNA，在不同腫瘤組織中表達不盡相同，其發揮的作用也有很大差別。例如：miR-144-3p在胰腺癌和人膠質母細胞瘤等組織中表達下調，且可通過誘導癌細胞凋亡并抑制細胞增殖、侵襲和遷移等發揮著類似抑癌基因的作用[5,16]；而miR-144-3p在透明細胞腎癌和甲狀腺乳頭狀癌等組織中表達上調，且可通過促進腫瘤細胞增殖、侵襲并抑制細胞凋亡等發揮著類似促癌基因的作用[17-18]。與上述結果相似，本研究結果表明上調miR-144-3p表達可促進口腔鱗癌CAL27細胞增殖、侵襲并抑制細胞凋亡，而下調其表達則可抑制CAL27細胞增殖與侵襲并促進細胞凋亡。提示miR-144-3p在口腔鱗癌發生發展過程中可能發揮著重要的促癌作用。但關于其如何調控下游基因尚未闡明。

本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-144-3p可靶向結合PTEN，并可負向調控PTEN的表達。PTEN是一種抑癌基因，可通過其脂質磷酸活性使PI3K/AKT信號通路上游PI3K去磷酸化而阻斷PI3K/AKT信號通路的活化，進而影響細胞生物學功能發揮抑癌作用[19-20]。已有研究[21]指出，PTEN在口腔鱗癌組織中低表達，可使PI3K/AKT信號通路活化，促進腫瘤細胞增殖、侵襲。為了探討miR-144-3p在口腔鱗癌中的致癌機制，本研究進一步檢測發現，上調miR-144-3p表達可使PTEN表達降低，而PI3K蛋白表達和AKT磷酸化水平明顯升高；反之，下調miR-144-3p可得到相反的結果。提示上調miR-144-3p表達可能通過負向調控PTEN的表達從而參與口腔鱗癌發生發展過程。該結果與Song L等[22]得出的miR-144-3p可通過靶向調控PTEN介導PI3K/AKT信號傳導促進鼻咽癌細胞增殖、侵襲并抑制細胞凋亡的分子機制相似。同時本研究將miR-144-3p inhibitor與si-PTEN共轉染至口腔鱗癌CAL27細胞，結果顯示細胞活力顯著升高，侵襲細胞數顯著增加，細胞凋亡率顯著降低，PTEN蛋白水平顯著降低，PI3K、p-AKT蛋白水平顯著升高，提示，miR-144-3p可能通過抑制PTEN表達進而促進PI3K/AKT信號通路活化導致口腔鱗癌的惡性進展。

綜上所述，在口腔鱗癌CAL27細胞中miR-144-p可促進細胞增殖、侵襲并抑制細胞凋亡，這可能是通過靶向調控PTEN/PI3K/AKT信號傳導實現的。