液相芯片技術進展及在檢驗醫學中應用

陳錚錚，呂火烊

作者單位： 310014 杭州，浙江省人民醫院

生物芯片技術是對生命體海量信息進行檢測和分析的重要手段，生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片、細胞芯片和組織芯片等。生物芯片雖在生物醫學領域的檢測、分析和研究中發揮了重要的作用，但仍存在較多不足。液相芯片技術因其所有反應都在液相中完成，是集微球編碼技術、液流控制技術、激光技術、生物技術及數字信號處理技術為一體的新型生物分子檢測技術。相比傳統固相生物芯片，液相芯片將固相平板載體替換為編碼微球，每個微球都攜帶一種可識別的編碼信息，以鑒別固定在其表面的探針。一旦微球表面探針種類被識別，探針所捕獲的靶分子就能被定性或定量分析，以實現高通量檢測，液相芯片技術是最適宜的高通量多指標檢測技術之一，本文擬對液相芯片技術的發展以及在檢驗醫學中的應用做一綜述。

1 液相芯片技術的發展

液相芯片又稱懸浮芯片，最早是1997 年美國Luminex 公司開發研制的多功能分析平臺，其所有反應都在液相中完成，有機地整合了熒光編碼微球技術、激光分析技術、流式細胞技術、高速數字信號處理技術及計算機運算法則等多項最新科技成果，在同一平臺上即可完成蛋白質和核酸的檢測等。液相芯片技術在保持高通量檢測的同時，將反應體系由液相－固相反應改變為接近生物系統內部環境的擬液相反應體系，有效確保了生物分子間的特異性反應，發生在正確的高級結構之上，大大提高了生物分子反應效率，縮短了檢測時間。通過不同染色功能化微球，快速對一個樣本進行多重檢測和分析。

在此基礎上Luminex 公司已研發出多種商品化的微球以供用于免疫和分子檢測試劑的開發。最初的xMAP 微球根據內部兩種熒光染料的光譜特征進行區分，可提供100 種光譜不同的微陣列，進一步使用3 種熒光染料將微陣列擴增至500 種。根據應用場景的不同，開發出了系列微球，如直徑5.6m 的未包被Microplex裸球為聚苯乙烯微球，攜帶羧基可共價結合捕獲分子，提供500 種不同的顏色組合。LumAvidin微球表面包被抗生物素蛋白，能夠結合生物素化的捕獲試劑，使待測分子因生物素和生物素蛋白間隔遠離微球表面，反應空間更加舒展。SeroMAP 是針對血清學檢測中出現的高背景而專門研發的微球，羧基化的微球可提供100 種不同的顏色組合，可減少非特異性的結合。MagPlex 是直徑為5.6m 的超順磁性微球，表面具有羧基功能基團，可提供500 種不同顏色的組合，可通過磁力作用與溶液分離，易于自動化和洗滌。

在不同熒光編碼的微球上可進行抗原、抗體、酶、底物、配體、受體的結合反應及核酸雜交反應。通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的，一個反應孔內可以完成多達100 種不同的生物學反應。迄今為止，全球已有數百套基于xMAP技術的檢測試劑用于免疫學、蛋白質、核酸檢測及基因研究等領域，該技術已成為一種新的蛋白質組學和基因組學研究工具，是最早通過美國食品與藥品管理局（FDA）認證的用于臨床診斷的生物芯片技術，并逐漸成為一種高通量代表性技術。美國Applied Bio Code Inc 公司又提出了一種全新的數碼液相芯片技術，采取數碼磁珠作為編碼元素，將順磁性材料摻入具有生物兼容性的高分子聚合物內，通過光刻法將12 位二進制的數字條碼刻到磁珠上，通過這種工藝制備得到4 096 種不同編碼的數碼磁珠，將蛋白、抗體或核酸分子偶聯在特定的磁珠上，通過特定的數碼液相芯片檢測儀器精準識別數碼磁珠上的數字條碼信號，進而實現高通量多指標的檢測。通過光刻法制備的數碼磁珠，其批間差小，且具有極穩定的表面化學特性，同時數碼磁珠上的條形碼圖案可以提供強對比度的信號，保證使用數碼液相芯片技術得到更加精準且穩定的檢測結果。

2 液相芯片技術的特點與優勢

2.1 高通量 可對同一樣本中的多種不同待測分子同時進行實時、定性、定量分析。在不存在交叉反應的情況下，檢測的通量等于編碼微球的種類數，理論上最多可達到上百甚至上千種，可以真正實現高通量、多指標的快速檢測。

2.2 樣本用量少 由于在同一個反應孔中可以同時完成幾十種不同的生物學反應，大大節省了樣本用量，少至0.1l 的樣本即可檢測，非常適合分析微小體積尤其是稀有樣品。

2.3 操作簡單、快速 由于是基于液相反應動力學，反應速度快，孵育時間大為縮短。免疫學分析可在1 ～2 h內完成檢測，核酸雜交分析在聚合酶鏈式反應（PCR）擴增后1 h 內可得到結果。不需要洗滌即可直接讀數，計算機分析處理系統的信號轉換能力強，可迅速得出統計結果，約1 h內即可完成96 個樣品的檢測，給出9 600 個數據，檢測效率大為提高。

2.4 靈敏度高 液相反應環境有利于保持蛋白質等的天然結構，有利于探針和檢測物之間的反應。微球表面積大，每個微球上可包被105～106個捕獲抗體，高密度的捕獲抗體保證了最大程度地與樣本中的抗原分子結合，提高檢測靈敏度，最低檢測濃度可達0.1pg/ml。

2.5 檢測范圍廣 可達3 ～5 個數量級，且樣品無需濃縮或稀釋。

2.6 特異性強 無需洗滌即可將與微球結合的和未結合的分子區分開來，只讀取單個微球上的熒光信號，信噪比好。兩束激光分別分析微球上的熒光和待測分子上報告分子的熒光，并且激光只分析一定半徑微球上的信號，檢測特異性強，背景信號低。

2.7 準確性高 采用熒光區分熒光編碼微球，每個微球都可高密度的共價結合探針分子，產生的信號強，微球上的報告分子熒光強度與結合的待測分子呈正比，且液相芯片技術的檢測范圍廣而減小誤差。

2.8 重復性好 液相芯片技術中的熒光讀值更加直接、穩定、靈敏，因每種微球檢測100 個，取熒光強度中值作為結果，相當于對每個樣本重復檢測了100次，檢測結果的準確性和重復性大為提高。

2.9 成本低 同時檢測一個樣本中的多項指標可節約時間、樣本、試劑、耗材和勞動，降低檢測成本，同時提高分析效率，還可隨檢測指標的增加進一步降低費用。

2.10 靈活性好 微球表面可以包被各種特異性探針，如抗原、抗體、寡核苷酸、酶底物或者受體，應用于免疫測定、酶學檢驗等分子生物學研究的多個方面，商品化試劑盒的使用者只需增減探針交聯微球和標記分子即可滿足不同檢測項目的需要。可應用于分子診斷、免疫診斷、伴隨診斷、個體化醫療及生命科學研究等。

3 國內液相芯片技術發展的現狀

由于具有高性能的熒光編碼微球制備過程復雜、涉及到多學科交叉、技術門檻很高，屬于體外診斷領域最為高精尖技術之一，國際上基本被Luminex 所壟斷。早期以美國Luminex 為代表的國外液相芯片技術以專利授權或合作形式進入中國，國內液相生物芯片技術起步較晚，其中較為出名的是上海透景生命科技股份有限公司，作為國內最早和Luminex授權與合作的公司，現已推出了多腫瘤標志物、人乳頭瘤病毒（HPV）的聯檢測試劑盒、優生優育試劑盒等。

另一些國內公司以新的技術路線，在多維編碼微球及熒光信號智能采集處理等方面進行創新，逐漸打破國外公司的技術壁壘，建立起中國自主知識產權的液相生物芯片技術體系。另外，研究者根據研究需要自行制備探針微球交聯微球，建立反應體系對各種標本進行檢測。

雖然以美國Luminex 成為液相芯片技術的代表，也是最適宜的高通量、多指標生物檢測技術發展方向之一，但仍然存在制約其發展的瓶頸。如編碼微球在制備時，將具有不同特性的熒光材料同時裝載在微球內部或者表面，幾種不同熒光特性的材料相互靠近會發生相互作用甚至干擾，從而影響編碼的精準性。由于微球空間的限制以及將熒光元素同時裝載在微球內部或者表面的方式，必須采用裝載特性相互兼容的熒光材料，限制了可用于編碼的熒光材料的選擇范圍與編碼容量。中翰盛泰生物技術股份有限公司與上海交通大學生物醫學工程學院在液相芯片技術上提出了“基于主客體結構的新型光學編碼微球新策略”，包含主體球和客體球兩個組成單元，每個組成單元都含有特定的編碼元素。以微米級顆粒為主體球，以納米顆粒為客體球，通過化學共價方式將大量客體熒光子球牢固結合至單個主體母球表面，獲得表面具有多級微納結構的主-客體復合微球。通過改變主、客體球的種類和不同客體球的配比，對復合微球的熒光特性進行精確調控。主、客體球中的編碼元素可以是有機染料、金屬化合物、量子點等多類新型熒光元素。這種新型編碼微球能有效避免不同熒光編碼元素之間的相互干擾。此外，不同主、客體球可以分別合成，將擴大熒光編碼元素的選擇范圍，依據熒光編碼元素本身特點在最合適的條件下進行單獨制備，并且具有多級微納拓撲結構的復合微球相對于傳統光滑表面的微球具有更大的比表面積，為待測靶分子的固定提供更多結合位點，提高多指標檢測的性能，并已經成功實現產業化。

4 液相芯片技術在檢驗醫學中的應用

4.1 細胞因子檢測方面的應用 同時檢測多種細胞因子可以全面判斷機體免疫功能，在疾病診斷、病程觀察及療效評價方面有重要意義，還能用于研究發病機制與藥物作用機制。

4.2 腫瘤標志物檢測方面的應用 腫瘤標志物是反映腫瘤存在的生物標志物，其存在或量變可以提示腫瘤的性質，借以了解腫瘤的組織發生、細胞分化及細胞功能，采用液相芯片技術檢測肺癌、婦科腫瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌及宮頸癌中相關的癌基因，經多項研究與化學發光法相比具有良好的相關性。

4.3 病原體檢測方面的應用 如采用液相芯片快速檢測結核耐藥基因和常見細菌大環內酯類和-內酰胺酶類耐藥基因，檢測幽門螺桿菌相關蛋白基因與臨床常見細菌大環內酯類和 內酰胺酶類耐藥基因，檢測乙型肝炎DNA、抗體和HBV 變異株，分別從蛋白質和核酸水平對乙型肝炎病毒進行檢測，對HPV病毒感染的疾病進行相關檢測，為預防宮頸癌的發生提供一種早期診斷依據，設計針對禽流感病毒H5N1 亞型的檢測方法等。

4.4 基因檢測方面的應用 只需在擴增基礎上，對擴增產物采用液相芯片進行分析即可，實驗簡單、易掌握、結果穩定可靠。如采用液相芯片技術檢測非小細胞肺癌患者的EGFR 基因突變，還可從男性不育、食管鱗癌、非小細胞癌及尖銳濕疣等方面采用液相芯片技術對相關基因突變進行研究，采用液相芯片技術研究PCR-LDR 對KRAS 基因分型的關系，采用液相芯片法檢測人HLA 相關基因從而為腎移植術后監測提供了依據，采用液相芯片檢測了青年女性胃癌組織和晚期胃癌患者的ERCC 1、TYMS、TUBB3 mRNA 的水平等。

除上述應用以外，液相芯片技術還可用于激素、炎癥因子中醫癥型、中樞神經系統性疾病、自身抗體、研究酶/底物與分析蛋白表達等方面。

5 液相芯片技術的發展趨勢與展望

鑒于液相芯片技術在核酸、蛋白質等生物大分子的大規模分析中具有巨大的應用潛力，還可用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體-配體識別分析蛋白質-蛋白質相互作用及蛋白質核酸相互作用分析等眾多領域的研究。隨著數字化技術的發展，數據處理系統的升級與數據處理能力的提升，以及檢測流程自動化水平的提高，并隨著人類對生命現象的認識不斷深入，對疾病檢測不再僅僅依賴于單一指標進行診斷，而是將人體作為一個完整的系統，利用多種指標的組合對疾病的發生、發展及預后進行更加精準的檢測、判斷以及治療指導。作為最適宜多指標同時檢測的技術，將會在“遏制疾病，診斷先行”得到更廣發的推廣和使用，除了將在檢測醫學中發揮作用，還將會在醫學基礎研究、新藥開發、司法鑒定和食品衛生監督等領域展現出廣闊的應用前景。