電針對(duì)于焦慮大鼠模型HPA 功能水平變化的影響

童秋瑜 沈衛(wèi)東 王 劍

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院針灸科，上海 201203

焦慮障礙嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，針灸對(duì)緩解其有明確療效，但作用機(jī)制尚不清楚。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在應(yīng)激焦慮發(fā)生中起重要作用，海馬有高密度表達(dá)的大麻素受體下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）軸是人體應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵通路,其活動(dòng)受海馬精細(xì)調(diào)控。目前公認(rèn)的機(jī)制是HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn)，體內(nèi)糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）水平過度升高，從而導(dǎo)致相應(yīng)部位的病理損傷。因此推測(cè)：海馬內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)調(diào)控HPA 軸在電針治療應(yīng)激所致焦慮障礙中發(fā)揮重要作用。本研究探討電針作用后海馬內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)變化，闡明其對(duì)HPA軸相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌因子和受體的調(diào)節(jié)以及在電針緩解應(yīng)激所致焦慮行為改變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)采取4～8 周的雌性SD 大鼠，SPF 級(jí)（合格證編號(hào)：20180004019270），體重200～220 g，每只籠位飼養(yǎng)4～6 只大鼠，按照國家部屬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)制訂的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，動(dòng)物房溫度23～25°C，相對(duì)濕度40%～50%，光照時(shí)間7∶00～19∶00；所有大鼠均都經(jīng)過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理機(jī)構(gòu)的許可，并遵循了上海中醫(yī)藥大學(xué)所制訂的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南。

1.2 主要試劑及耗材

AM-251（MCE 生產(chǎn)，貨號(hào)：HY-15443）；針灸針（蘇州醫(yī)療用品有限公司，0.35 mm×13 mm）；促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0565R1）；皮質(zhì)醇（CORT）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0559R1）；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0520R1）；糖皮質(zhì)激素（GC）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，MM-0986R1）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器或器械

大鼠自發(fā)活動(dòng)箱（上海昆盟生物科技有限公司）；高架十字迷宮（上海昆盟生物科技有限公司）；束縛裝置（上海昆盟生物科技有限公司）；電針儀（上海華誼醫(yī)用儀器，BT701-1B）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo，multiskan GO）；全自動(dòng)雪花制冰機(jī)（常熟雪科，MS-20）；超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（美菱，DW-HL528S）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建立大鼠焦慮模型 采用單次延長(zhǎng)應(yīng)激法建立術(shù)前焦慮模型[1]，大鼠束縛2 h 后強(qiáng)迫游泳20 min，最后把大鼠放回籠位。具體簡(jiǎn)述如下：①取直徑4 cm 的PVC 管（以不影響大鼠呼吸同時(shí)使之無法自由活動(dòng)身體為準(zhǔn)），截為40 cm 長(zhǎng)的一段，一端封堵但保持透氣，待大鼠放入后封閉另一端，靜置保持2 h；②強(qiáng)迫游泳裝置為一個(gè)直徑80 cm 水池，水深50 cm，水面距水池上緣35 cm；強(qiáng)迫游泳20 min。③結(jié)束強(qiáng)迫游泳的大鼠用毛巾擦拭后，再以電吹風(fēng)吹干毛發(fā)，休息15 min后，吸入異氟烷麻醉至意識(shí)消失放回籠內(nèi)令其自然蘇醒。通過評(píng)估曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中大鼠邊緣區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)開放臂停留時(shí)間降低來判斷大鼠是否存在焦慮樣行為。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與干預(yù)方法 具體分組如下（每組12 只）。對(duì)照組（正常飼養(yǎng)不做處理）；模型組（單次延長(zhǎng)應(yīng)激法焦慮模型）；假電針組（穴位附近刺淺表，留針不通電）；電針組（針刺百會(huì)、神門、內(nèi)關(guān)、印堂，2 Hz，1 mA，持續(xù)15 min）；E：AM251（1 mg/kg 體重，針刺前30 min 腹腔注射）+電針組（穴位同電針組）；F：AM251+假電針組（方法同假電針組）。造模結(jié)束后的次日，開始對(duì)大鼠進(jìn)行針灸及藥物干預(yù)。對(duì)于針灸組的大鼠，主要參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》和《大鼠穴位圖譜的研制》[2]，選取百會(huì)、神門、內(nèi)關(guān)、印堂四穴，以“華佗牌”一次性針灸用針（針徑0.35 mm，長(zhǎng)13 mm）進(jìn)行針刺，定位及針刺方法如下。百會(huì)穴：頂骨正中，向后斜刺2 mm；神門穴：前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣，直刺1 mm；內(nèi)關(guān)穴：前肢內(nèi)側(cè)，距腕關(guān)節(jié)約3 mm 尺橈骨縫間，直刺1 mm；印堂穴：雙眼之間中點(diǎn)向上約3 mm，向后斜刺2 mm。進(jìn)針后連接電針治療儀，設(shè)置2 Hz頻率連續(xù)波刺激，電流強(qiáng)度1 mA，留針15 min，每天1 次，干預(yù)時(shí)間為3 d。對(duì)于假針刺組，于穴位附近刺淺表，留針不通電。對(duì)于AM251 干預(yù)組，每天于針刺前30 min，按照1 mg/kg 體重的劑量腹腔注射，其他各組注射等體積的生理鹽水；AM251 是選擇性大麻素1（CB1）受體拮抗劑

1.4.3 行為學(xué)檢測(cè) ①曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test）。針灸干預(yù)3 次后的次日進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)。觀察指標(biāo)：通過觀察大鼠爬行中央格次數(shù)與時(shí)間、外周格次數(shù)與時(shí)間以及運(yùn)動(dòng)的總距離，計(jì)算出爬行的總格數(shù)、中央格爬行次數(shù)占爬行總格數(shù)的比例以及中央格停留時(shí)間占總時(shí)間的百分比[3]。大鼠三爪以上跨入鄰格才能計(jì)數(shù)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)專用活動(dòng)箱由不反光的黑色亞克力材料制成，l00 cm×100 cm×40 cm（長(zhǎng)×寬×高），底板25 個(gè)20 cm×20 cm 方格，四周16 個(gè)方格為外周格，剩下的9 個(gè)方格為中央格，將大鼠放在中央格，觀察5 min 內(nèi)活動(dòng)情況。在測(cè)試實(shí)驗(yàn)時(shí)保證整個(gè)環(huán)境安靜無干擾。記錄并分析數(shù)據(jù)，通過評(píng)估中央格爬行次數(shù)及停留時(shí)間來推測(cè)大鼠的焦慮樣行為。每次實(shí)驗(yàn)后用75%酒精對(duì)曠場(chǎng)裝置進(jìn)行清理，消除異味。②高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）。EPM 實(shí)驗(yàn)將大鼠輕輕放至迷宮的中心區(qū)域，使之面向開放臂，記錄大鼠6 min 內(nèi)的探索活動(dòng)。觀察指標(biāo)：大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)及停留時(shí)間、閉合臂次數(shù)及停留時(shí)間[4]。實(shí)驗(yàn)裝置由不反光的黑色亞克力材料制成，具體為兩個(gè)閉合臂（50 cm×10 cm×40 cm），兩個(gè)開放臂（50 cm×10 cm）及中心區(qū)域（10 cm×10 cm）連接而成，離地面約70 cm高。每只大鼠測(cè)試結(jié)束后，用75%酒精棉片擦拭實(shí)驗(yàn)裝置以去除殘留的氣味。③ELISA 檢測(cè)。使用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，所有步驟按說明書操作。測(cè)試完成后分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各組大鼠血漿中各值含量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad 7 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖片數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 法。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)單次延長(zhǎng)應(yīng)激法大鼠模型焦慮行為發(fā)生的影響

通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠焦慮行為，相對(duì)于對(duì)照組，模型組大鼠邊緣區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，開放臂停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與模型組比較，電針組中可見邊緣區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間縮短而開放臂停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P ＜0.05）。與電針組比較，假電針組、AM251+電針組大鼠邊緣區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，開放臂停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 電針對(duì)單次延長(zhǎng)應(yīng)激法大鼠模型焦慮行為發(fā)生的影響

2.2 電針對(duì)HPA 軸減輕焦慮的調(diào)控

相對(duì)于對(duì)照組，模型組血清ACTH、CORT、CRH、GC 蛋白釋放明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，電針組可以明顯抑制上述蛋白在血清中表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與電針組比較，假電針組、AM251+電針組血清ACTH、CORT、CRH、GC 蛋白釋放明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖2。

3 討論

3.1 中醫(yī)針灸在治療創(chuàng)傷后應(yīng)激所致焦慮障礙具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)

應(yīng)激是指大腦在應(yīng)對(duì)確定事件或環(huán)境時(shí)所表現(xiàn)出來的反應(yīng)，慢性應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生一些有害的影響[5]。由于抗焦慮藥物存在著許多的副作用或不良反應(yīng)，限制了這些藥物在臨床上的廣泛使用[6]。在西醫(yī)治療中的非藥物療法主要以心理療法為主[7]。因此，開發(fā)新穎有效的治療焦慮癥方法已成為重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)課題。

中醫(yī)針灸可以緩解焦慮障礙改善焦慮情緒，尤其是對(duì)軀體癥狀[8]。目前，電針療法應(yīng)用于焦慮的治療最為廣泛[9]。本研究結(jié)果提示，電針具有很好減輕焦慮發(fā)生。因此需要進(jìn)一步探討針灸是如何減輕創(chuàng)傷后應(yīng)激所致焦慮。

3.2 中醫(yī)針灸激活海馬內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（eCB）減輕焦慮機(jī)制

圖2 電針對(duì)HPA 軸減輕焦慮的調(diào)控

中醫(yī)按照病情癥狀，將焦慮癥歸屬于情志病的范疇[10]。內(nèi)源性大麻素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要結(jié)合突觸前膜上的大麻素Ⅰ型受體（cannabinoid 1 receptor，CB1R）[11]，可抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[12]。AM251 是CB1應(yīng)用最為廣泛的受體拮抗劑。在杏仁核內(nèi)，在糖皮質(zhì)激素促進(jìn)內(nèi)源性大麻素的釋放同時(shí)，大麻素亦可以通過HPA 軸調(diào)控局部和遠(yuǎn)端糖皮質(zhì)激素的分泌[13]。CB1R 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布。杏仁核-海馬是調(diào)控情緒反應(yīng)行為的關(guān)鍵區(qū)域，其內(nèi)的CB1R 密度含量最高[14]。使用CB1R 拮抗劑治療疾病可能破壞內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)功能，導(dǎo)致患者出現(xiàn)抑郁、焦慮樣行為或癥狀[15]。最新研究發(fā)現(xiàn)電針刺激大鼠百會(huì)穴可調(diào)節(jié)海馬上內(nèi)源性大麻素受體CB1 的表達(dá)，提高內(nèi)源性大麻素分解酶和合成酶的活性[16]。CB1 信號(hào)通路活化可產(chǎn)生針灸治療時(shí)的相同生物學(xué)效應(yīng)[17]。電針刺激的神經(jīng)保護(hù)作用可被內(nèi)源性大麻素受體拮抗劑阻斷[18]。電針反復(fù)來刺激小鼠的百會(huì)穴通過CB1 受體能夠產(chǎn)生明顯的止痛效果[19]。AM251 可抑制電針刺激后大鼠CB1 受體的高表達(dá)，導(dǎo)致電針的鎮(zhèn)痛作用減弱[20]。

3.3 HPA 軸在針刺治療焦慮的作用

本研究通過ELISA 觀察HPA 軸變化，主要通過測(cè)得血清中ACTH、CORT、CRH、GC 含量來反映出單次延長(zhǎng)應(yīng)激對(duì)成年老鼠HPA 軸的影響以及電針是否可以減輕其釋放，阻斷電針調(diào)配受體是否可以干預(yù)電針對(duì)HPA 軸的影響。HPA 軸是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)過程的中樞，CRH、ACTH、CORT 三者在HPA 軸上相互關(guān)聯(lián)、相互影響。人體受到應(yīng)激刺激時(shí)，CRH 可隨著門脈系統(tǒng)的血液進(jìn)入后垂體前葉，作用于垂體前葉使其釋放ACTH，導(dǎo)致CORT 的分泌增加[21]。海馬是應(yīng)激損傷的敏感區(qū)及HPA 軸應(yīng)激反應(yīng)鏈上的高位負(fù)反饋調(diào)節(jié)中樞，可抑制HPA 軸的應(yīng)激反應(yīng)，并將HPA 軸在應(yīng)激下的亢進(jìn)功能恢復(fù)到正常水平[22]。HPA 軸活性與內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)緊密有關(guān)。內(nèi)源性大麻素通過與突觸前軸突末端的CB1 結(jié)合抑制γ-氨基丁酸及谷氨酸鹽的釋放。當(dāng)缺失CB1 或使用受體拮抗劑后，ACTH 水平升高，糖皮質(zhì)激素分泌增多。大麻素通過抑制下丘腦室旁核CRH 分泌性神經(jīng)元谷氨酸鹽的傳入，減少CRH 的分泌，從而抑制HPA 軸所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)[23]。HPA 軸興奮，GC 分泌增多是應(yīng)激最主要的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)之一。當(dāng)過度應(yīng)激，HPA 軸過度激活，高濃度的GC 可引起海馬神經(jīng)元變性和損傷，提示GC 對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的此類損傷很可能是心理應(yīng)激導(dǎo)致精神損傷的機(jī)制之一[24]。針刺可能引起HPA軸功能改變。電針神門、三陰交可降低心理應(yīng)激失眠大鼠CRH、ACTH、CORT 水平，而申脈、照海穴可調(diào)節(jié)HPA 軸上相關(guān)激素的釋放或分泌，來治療失眠[25]。以上研究提示，HPA軸是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的主要通路，與內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)和針刺存在著緊密聯(lián)系。本研究顯示，HPA 軸的活化跟焦慮密切相關(guān)，其分泌的激素ACTH、CORT、CRH、GC 在某種方面導(dǎo)致焦慮發(fā)生，而電針通過CB1 受體調(diào)控HPA 軸抑制激素分泌減輕焦慮。

本研究探討電針作用后海馬內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)變化，通過構(gòu)建單次刺激大鼠模型，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)大鼠術(shù)后焦慮變化，并對(duì)其分泌蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，證明了此通路在大鼠焦慮發(fā)生中的重要作用。本研究下一步繼續(xù)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量，加深機(jī)制方面研究，深入探討電針減輕焦慮的機(jī)制。