Gαi2C-末端肽段靶向超聲造影劑的制備及靶向性評價

蔣 華 穆玉明 王春梅 周賢惠 張 健

1.成都大學附屬醫院老年病科，四川成都 610081；2.新疆醫科大學第一附屬醫院超聲醫學中心心臟超聲診斷科，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆醫科大學第一附屬醫院心臟中心，新疆烏魯木齊 830011

靶向超聲造影劑是近年來超聲醫學領域研究的熱點之一。超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一種非病毒載體的基因轉染方式，其具有操作簡單、安全快捷、靶器官高度特異性等優勢，可用于心肌基因治療[1-3]。

研究表明[4]，迷走神經張力異常與陣發性房顫的發生密切相關，阻斷迷走神經可以降低房顫的發生率[5]。G 蛋白信號轉導途徑通過調控自主神經活性從而達到誘發和維持房顫發生的作用。Gαi2C-末端肽段（Gαi2C-terminal peptide，Gαi2ctp）可以干擾Gαiβγ 三聚體的解離，阻斷G 蛋白信號轉導途徑，降低自主神經介導的房顫發生[6-7]。故本研究采用靜電吸附法將其連接到造影劑SonoVue 微泡表面，并量化尋找最佳攜帶劑量，利用UTMD 提高其到達心臟的效率，從而為Gαi2ctp 成功轉導至體內發揮其生物學效應奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

超聲微泡造影劑SonoVue（意大利BRACCO，15A022A）；熒光標記的Gαi2ctp[5-羧基四甲基羅丹明（5-TAMRA）-Gαi2ctp，廣州特立生物科技有限公司特約合成]；流式細胞儀（美國，Beckman Cytometer GALLIOS）；漩渦混合器（廣州，IKAMS-3）；熒光倒置顯微鏡（德國，LEICA CTR6000）；彩色多普勒超聲診斷儀（美國，GE VIVID 7 DIMENSON）。

1.2 Gαi2ctp 靶向微泡的制備及分組

采用靜電吸附法制備靶向微泡，根據Aistrup 等[6]的研究結果，將5-TAMRA-Gαi2ctp 分為0.5、1.5、3 mg/L三組，生理鹽水溶解后與SonoVue 微泡混懸液混和，室溫下充分混勻，調整pH 值至4.5，漩渦混合器振蕩約1 min，室溫下孵育、靜置。采用浮選法[8]洗滌：將混懸液置于離心管中，加入等量的0.9%氯化鈉，轉速400 r/min、離心1 min、離心半徑1.5 mm（至微泡聚集在液相的頂部），棄去下清液，重復洗滌2 次。每組平行6 次。

1.3 Gαi2ctp 靶向微泡的鑒定

1.3.1 體外評價 ①熒光顯微鏡下觀察Gαi2ctp 與微泡的結合情況，靶向微泡的形態及分布；②流式細胞儀評價靜置0.5、1、2 h Gαi2ctp 靶向微泡的攜帶率及洗滌前后Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率。

1.3.2 體內評價 ①實驗分組及房顫模型制備：成年健康雜種犬14 只，雌雄不拘，體重14～23 kg，平均（15.6±4.8）kg；年齡2～5 歲，平均（2.3±1.1）歲。依據隨機數字表將其分為實驗組（攜1.5 mg/L Gαi2ctp 靶向微泡）及對照組（SonoVue 空白微泡），每組7 只，參照Xue 等[9]的方法制備犬房顫模型。本實驗通過新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗中心倫理委員會審核批準（批準號：A-20101020001）。

②利用UTMD 靶向轉導Gαi2ctp：兩組犬分別由靜脈注入攜1.5 mg/L Gαi2ctp 靶向微泡和SonoVue空白微泡，應用相同的超聲條件進行輻照治療：采用Vivid 7 彩色多普勒超聲診斷儀，M3S 探頭，二次諧波造影模式，機械指數爆破前后分別為0.08、1.0，FLASH擊碎微泡，心電觸發在左心房定點爆破，每6 個心動周期擊碎一次，直至心腔內微泡完全消失。實驗結束后，行犬左心房組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察犬左心房及肺靜脈熒光物質表達情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多個時間點比較采用重復測量方差分析，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微泡的外觀及熒光檢驗

Gαi2ctp 靶向微泡熒光顯微鏡下可見外殼熒光染色均勻，呈環狀，微泡表面發出橙紅色熒光。見圖1。

圖1 Gαi2ctp 靶向微泡微熒光顯微鏡下圖（200×）

2.2 流式細胞儀檢測結果

2.2.1 不同靜置時間Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率比較三組時間、組間及交互作用比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。1.5 mg/L 組靜置0.5、1、2 h Gαi2ctp靶向微泡攜帶率高于3 mg/L 組，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01）；1.5 mg/L 組與0.5 mg/L 組靜置0.5、1、2 h Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率比較差異無統計學意義（P ＞0.05）。3 mg/L 組不同時間Gαi2ctp 攜帶率比較，差異有統計學意義（F=7.330，P=0.030）。見表1。

2.2.2 洗滌前后Gαi2ctp 攜帶率比較 1.5 mg/L 組洗滌前后攜帶率比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。3 mg/L 組和0.5 mg/L 組洗滌后Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率低于攜帶前，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01）。見表2、圖2。

表1 不同靜置時間Gαi2ctp 靶向微泡的攜帶率比較（%，，n=6）

表1 不同靜置時間Gαi2ctp 靶向微泡的攜帶率比較（%，，n=6）

注：與1.5 mg/L 組同期比較，aP ＜0.01。Gαi2ctp：Gαi2C-末端肽段

表2 洗滌前后Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率比較（，n=6）

表2 洗滌前后Gαi2ctp 靶向微泡攜帶率比較（，n=6）

注：與本組洗滌前比較，aP ＜0.01。Gαi2ctp：Gαi2C-末端肽段

2.3 Gαi2ctp 微泡靶向性的體內評價

熒光顯微鏡下觀察，實驗組左心房及肺靜脈激發出橙紅色熒光，而對照組無熒光物質聚集。見圖3。

3 討論

超聲分子成像是一種新型的非侵入性生物分子顯像技術，而靶向微泡造影劑的構建是超聲分子成像的基礎[10]。微泡造影劑與特異性抗體或配體偶聯的結合方法多種多樣，每種方式各有優劣[11-13]。本實驗采用的靜電吸附法是利用脂質微泡的化學雙極性（疏水端和親水端），通過自身離子鍵、物理吸附（范德華力）等方法將目標配體Gαi2ctp 偶聯在微泡殼膜上，制成靶向微泡。造影劑SonoVue 含磷脂單層，性質穩定，安全性好。將羅丹明磺化的目的是通過親電取代反應用磺酸基（-SO3H）取代其本身的氫離子，增加其水溶性和生物學活性。近幾年，不少國內學者們嘗試用靜電吸附法制備靶向造影劑[14-16]。岳媛媛等[17]利用靜電吸附法將靶向微泡與大鼠骨髓間充質干細胞偶聯，制備出靶向微泡-干細胞復合體，進一步拓寬了此方法在超聲醫學領域的應用。本研究結果顯示，靶向造影劑在熒光顯微鏡下激發出橙紅色熒光，1.5 mg/L 組Gαi2ctp 微泡造影劑攜帶率最高，洗滌前后攜帶率變化不大。

圖2 各組Gαi2ctp 靶向微泡造影劑攜帶率檢測結果

圖3 左心房及肺靜脈冰凍切片熒光顯微鏡結果圖（50×）

制備成功的Gαi2ctp 造影劑微泡能否成功到達靶組織，是驗證其靶向性的關鍵。近年來，UTMD 成為超聲醫學領域一種新型的基因傳輸及靶向給藥方法，廣泛應用于腫瘤、心血管疾病的基因治療等領域[18-21]。當靶向微泡到達特定組織時，利用UTMD 產生的空化效應、聲孔效應、內吞作用和聲輻射力等，提高細胞和毛細血管的通透性，從而增加基因轉染效率，是一種理想的基因載體系統[22-23]。Chen 等[24]應用UTMD 將含胰高血糖素樣肽-1 基因PB 轉座子的質粒微泡轉導至心肌病大鼠體內，通過胰高血糖素樣肽-1 基因刺激心肌再生，治療阿霉素心肌病。遲婷婷等[25]應用UTMD將成纖維細胞生長因子（aFGF）轉導至大鼠心肌組織，證實微泡靶向轉導aFGF 可以改善糖尿病心肌病大鼠左心室心肌血流灌注。本研究試圖利用UTMD 將Gαi2ctp 定向輸送至犬左心房，體內實驗結果發現，實驗組犬左心房及肺靜脈可見明亮的橙紅色熒光表達，對照組未出現橙紅色熒光，提示Gαi2ctp 成功轉導至犬左心房及肺靜脈組織。

因此本研究認為利用靜電吸附法可以成功制備Gαi2ctp 靶向微泡，其性質穩定，目的肽段攜帶率高，靶向性明確，方法簡便易行，從而為研究外源性Gαi2ctp的生物學效應提供有力的支持。