星點設計-效應面法優選小兒益肺健脾煎膏劑提取工藝研究

韋艷萍 譚梔恩 陀海燕 曾佩琴 劉雅婷 覃柳馨 易 蔚 陳衛衛,2,3

1.廣西中醫藥大學藥學院，廣西南寧 530001；2.廣西中藥制劑共性技術研發重點實驗室，廣西南寧 530001；3.廣西壯瑤藥重點實驗室，廣西南寧 530001

小兒益肺健脾煎膏劑出自廣西中醫藥大學第一附屬醫院臨床經驗方，具有健脾益氣、消食化積、調和營衛、斂汗生津的功效，主要用于治療小兒肺脾氣虛、免疫力低下、自汗、腹脹厭食、便溏等病癥，效果良好。該方由陳皮、太子參、白術、山藥、蓮子肉、桂枝、炒山楂、炒雞內金、炒麥芽、桔梗、浮小麥等組成，臨床以湯劑入藥，存在臨用需煎煮、服用劑量大、患者順應性差、易霉變、攜帶儲存不便等缺點，為使其攜帶、服用方便且能達到較高的利用率，將湯劑改為煎膏劑。煎膏劑有效物質浸出量較多，利用率高，可服用較長時間，吸收快，服用方便，較易貯存，益于滋補，適用于慢性病和久病體虛者。陳皮、太子參、白術為君藥，具有平補脾胃之氣、健脾益肺的功效[1-4]；臣藥以山藥、蓮子肉助君藥健脾益氣，輔白術以健脾滲濕，桂枝溫養脾胃、調和營衛；佐以炒山楂、炒雞內金、炒麥芽消食化積，使上下氣機貫通則脾胃運化健旺，腹脹厭食可除；桔梗宣肺利氣、載藥上行、培土生金，浮小麥固澀斂汗，共為佐使之用。君藥陳皮中的橙皮苷能夠增強機體免疫功能[1-3]。現代藥理研究[5-7]顯示，太子參中苷類及多糖類等成分能夠提高機體免疫功能，白術多糖與白術揮發油均有一定的免疫調節作用[8-11]。以中醫藥理論為指導，運用現代制劑技術，對處方藥材有效成分提取精制，制成小兒益肺健脾煎膏劑，夠調節身體機能，起到健脾益氣的效果，提高小兒免疫力，滿足小兒健康成長需求，具有廣闊的開發空間和潛在的市場前景，值得深入研究與開發。

結合工業化大生產特點及實際科研情況，將橙皮苷含量和干膏率的總評“歸一值”（OD）值作為評價指標，按照單因素試驗和二因素五水平星點設計進行提取工藝實驗優選小兒益肺健脾煎膏劑提取工藝，為該制劑的后續研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Waters 2695，美國Waters 科技有限公司）；電熱鼓風干燥箱（GZX-9420MBE，上海博訊實業有限公司醫療設備）；Thermo 離心機（TGL-16G，賽默飛世爾科技公司）；電子天平（JM-A5002，諸暨市超澤衡器設備有限公司）；超純水器（UPC-II-10T，四川優普超純科技有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（HWS-12，上海齊欣科學儀器有限公司）；電子調溫電熱套（98-1-B，天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號：110721-201617）；甲醇（色譜純，美國Fisher 公司，批號：178500）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司，批號：175165）；磷酸（分析純，成都金山化學試劑有限公司；批號：20161202）；水為超純水；藥材購自廣西仙茱中藥科技有限公司，由廣西中醫藥大學寧小清高級實驗師鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》[12]2015 年版一部要求。

2 方法與結果

2.1 測定橙皮苷含量

2.1.1 色譜條件

采用反相色譜柱Inertsil ODS-3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇（A）-乙腈（B）-0.1%磷酸溶液（C）作為流動相，梯度洗脫0～30 min（A：10%～30%，B：10%～30%，C：10%～40%），流速為1 mL/min，檢測波長為283 nm，柱溫為35℃，進樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱定適量橙皮苷對照品，加80%甲醇制成含0.80 mg/mL 的橙皮苷對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

稱取處方量藥材，加入9 倍水，煎煮法提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，定容。取適量溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.1.4 陰性干擾溶液的制備

稱取除陳皮外的所有藥材，按“2.1.3”項下方法制備陰性干擾溶液。

2.1.5 測定法

分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性干擾溶液，進樣量為10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.6 方法學考察

2.1.6.1 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液8、10、12、14、16、18 μL，按“2.1.1”項下色譜條件測定。以對照品進樣量（μg）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），得回歸方程Y=1277.527 88 X+7.284 272 9（r=0.99996），結果表明橙皮苷進樣量在0.8000～1.8000 μg 范圍內呈良好的線性關系。見圖2。

圖2 橙皮苷標準曲線圖

2.1.6.2 精密度試驗 按“2.1.1”項下色譜條件，精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液，重復進樣6 次，測定峰面積，RSD 為1.37%，表明儀器的精密度良好。見表1。

表1 精密度試驗（n=6）

2.1.6.3 重復性試驗 稱取同一批藥材6 份，按“2.1.3”項下制備樣品溶液，測定橙皮苷峰面積，RSD 為1.24%，表明測定方法的重復性良好。見表2。

表2 重復性試驗結果（n=6）

2.1.6.4 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液，在0、4、12、24、36、48 h 進樣，測定橙皮苷峰面積，RSD 為1.86%，表明供試品溶液在48 h 內穩定。見表3。

表3 穩定性試驗結果（n=6）

2.1.6.5 回收率試驗 精密稱定同一批藥材9 份，按樣品中成分80%、100%、120%的比例加入對照品各3 份，按“2.1.3”項下供試品溶液，測定橙皮苷含量，平均回收率分別為97.02%、97.58%、98.18%，RSD 分別為2.09%、1.86%、1.83%。加樣回收率（%）=（測得量-原有量）/加入量×100%。見表4。

表4 加樣回結果（n=9）

2.1.7 樣品含量測定

精密稱取3 批藥材，按“2.1.3”項下制備供試品溶液，測定峰面積，計算得出橙皮苷的平均含量為321.432 mg/g，RSD 值為1.88%。見表5。

表5 含量測定結果（n=3）

2.2 干膏率的測定

精密吸取定容后的供試品溶液20 mL，置恒重蒸發皿，水浴蒸干后，105℃下干燥5 h，置干燥器冷卻至室溫，迅速精密稱定，干燥1 h，至連續兩次重量差異≤5 mg，計算干膏率（%）[13-14]。干膏率=（干膏重量/取樣體積）×（藥液體積/藥材重量）×100%。

2.3 藥材吸水率的考察

稱取同批藥材6 份，加10 倍量水浸泡0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 濾凈水稱重[15]，吸水率%=（濕藥材重量-干藥材總重量）/干藥材總重量×100%。見表6。

表6 吸水率考察結果（%，n=6）

3 單因素試驗與結果

基于原方提取工藝、成本考慮，選擇水提取。綜合考慮能源損耗、后續放大生產的合理性、提取次數的非連續性，提取兩次。綜合預實驗結果及文獻報導對橙皮苷含量、干膏率測定影響較大的加水倍數和提取時間[16-18]兩個因素水平的合理取值范圍進行考察。

3.1 提取時間的考察

稱取藥材7 份，分別加10 倍量水，煎煮兩次，每次60、90、120、150、180、210、240 min，濾過，合并濾液，定容，離心，經0.22 μm 微孔濾膜濾過。按“2.1.1”項下色譜條件與“2.2”項下方法測定橙皮苷含量和干膏率。由表7 可知，橙皮苷含量和干膏率隨提取時間增加而增加，240 min 時橙皮苷含量略有下降，干膏率無明顯變化。故提取時間范圍選為90～240 min。

表7 提取時間考察結果

3.2 加水倍數的考察

稱取7 份藥材，分別加入6、9、12、15、18、21、24 倍水，煎煮2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，定容，離心，微孔濾膜過濾，按“2.1.1”項下色譜條件與“2.2”項下方法測定橙皮苷含量和干膏率。由表8 可知，橙皮苷含量和干膏率均隨加水倍數增大而升高，加水倍數為21 倍時，干膏率不再明顯增加，故加水倍數范圍為9～24 倍。

表8 加水倍數考察結果

4 提取工藝優選

4.1 試驗設計

基于單因素試驗結果及實際生產經驗，提取2 次，將加水倍數、提取時間作為考察因素，按星點設計原理，進行二因素五水平試驗。見表9。

表9 因素與水平表

4.2 星點設計實驗安排及結果

采用Hassan 方法標準化的將本實驗評價指標（橙皮苷含量和干膏率）取值越大越好分別轉化為0～1 間的OD 值，按OD=（d1×d2…dk）1/k（k 為指標數），轉換公式為di=（yi-ymin）/（ymax-ymin）[19-20]。見表10。

表10 星點設計實驗安排及結果

4.3 模擬擬合

應用Design-Expert 8.0.6 進行數據分析，以OD 值對兩因素進行多元線性回歸，多元擬合方程為Y=-1.138 35+0.049 458X1+5.481 28×10-3X2（r=0.8823，P ＜0.01），表明OD 值與兩個影響因素之間線性相關較差，回歸擬合度不佳，預測性不好，該模型不合適，故采用多元二次項擬合分析。二次項擬合方程為Y=-3.374 60+0.186 70X1+0.020 304X2-1.78142×10-4X1X2-3.268 25×10-3X12-3.600 96×10-5X22（r ＝0.9724，P ＜0.01）。表明非線性r 值較高，擬合效果較好。

4.4 方差分析

采用SPSS 18.0 統計學軟件進行數據分析，由表11 可知，多元二次項回歸方程失擬檢驗無顯著性，未知因素對試驗結果影響很小。模型具有高度顯著性，該方程與實際情況擬合較好，很好地反映了此模型的可靠性。除X1X2回歸系數不顯著外，其他均達到顯著水平。

4.4 效應面優化和預測

采用Design-Expert 8.0.6 軟件，得到三維效應曲面圖和等高線圖，由圖3～4可知加21 倍量水、提取212 min 時，預測總評OD 值為1.001 61。結合實驗操作及實際工業大生產情況，最佳工藝條件確定為加21 倍量水，提取2 次，每次212 min。

表11 方差分析結果

圖3 加水倍數和提取時間對總評OD 影響的三維效應面圖

圖4 加水倍數和提取時間對總評OD 影響的二維等高圖

4.5 驗證試驗

依上述最優工藝進行實驗。實測OD 值為0.836 30，較方程預測值，偏差率[21，23]為-16.531%。表明所建立的數學模型具有良好的預測性，所選工藝條件穩定性、重現性好。見表12。

5 討論

參考《中華人民共和國藥典》[12]2015 年版陳皮藥材含量測定方法，考察流動相（甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸）全梯度洗脫，結果甲醇-0.1%磷酸分離時間較長，乙腈-0.1%磷酸分離度不穩定，優化甲醇-乙腈-0.1%磷酸，橙皮苷含量測定分離效果好。考察不同柱溫（25℃、30℃、35℃）的分離效果，35℃時，分離時間較快、效果好。

研究表明[5-7]，太子參有效成分多糖能增強免疫功能，但含量較低且測定方法繁瑣，可操作性差。白術有效成分白術內酯Ⅰ具有健脾作用[24-25]，但其含量較低及原料含量差異大，品質難以把控，故不考慮作為檢測指標。君藥陳皮有效成分橙皮苷能夠調節免疫功能，從而起到健脾作用[1-3]，故將君藥陳皮中橙皮苷含量作為檢測指標，太子參與白術作為定性檢測，把控制劑質量。

正交設計法、均勻設計法作為國內比較成熟的試驗設計優化方法，簡單易行，結果易得，但精度不夠。星點設計-效應面法更全面，試驗次數較少，試驗精度高，并適用于多因素、多水平試驗、數據處理簡便。試驗結果由軟件直接讀出，并進行預測，減少主觀因素的影響[26-27]。因此，本實驗采用星點設計-效應面法優化小兒健脾益肺煎膏劑提取工藝，實際值與預測值偏差在合理范圍內，表明此方法預測效果良好、可靠。

表12 驗證試驗結果