江蘇地區人群線粒體DNA 12S rRNA A1555G和C1494T 位點突變分析

李孟蘭 林 寧 石 慧 王麗娟 姜志欣 黃麗麗 吳玉璘

江蘇省計劃生育科學技術研究所實驗篩檢中心 江蘇省生殖健康檢驗中心，江蘇南京 210036

耳聾是我國常見的一種感覺神經系統缺陷性疾病，嚴重影響著患者本人及家庭人員的生活質量。耳聾是由遺傳因素、環境因素或遺傳與環境因素交互作用引起的，其中由遺傳因素造成的耳聾約占所有耳聾患者的50%～60%[1]。按照遺傳方式分類，遺傳性耳聾又可分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X 連鎖遺傳和線粒體遺傳等[2-3]，其中線粒體遺傳是一種母系遺傳，其突變基因只能由母親遺傳給子代[4]，可能的原因是受精后的卵母細胞內存在可以針對性地破壞父源性線粒體DNA 的物質[5]。線粒體DNA 12S rRNA是氨基糖苷類抗生素誘導的非綜合癥性耳聾研究中的一個熱點區域，其中A1555G 和C1494T 這兩個位點的突變是目前公認的與藥物性耳聾密切相關的致病性突變，可引起突變攜帶者對氨基糖苷類抗生素表現出高度敏感[6]，在應用常規治療劑量甚至微量的氨基糖苷類抗生素之后，即可在短時間內引起聽力不可逆的損傷，導致“一針致聾”的現象的發生[7-8]。了解江蘇地區藥物性耳聾基因線粒體DNA 12S rRNA 的突變情況，為制訂本地區藥物性耳聾的防治策略提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇江蘇鎮江、泰興、如皋、高郵、漣水、沭陽6 個項目點中參加耳聾基因篩查的1843 例作為研究對象，按是否耳聾以及有無家族史分為三組，其中非綜合征性耳聾患者904 例為耳聾組，男460 例，女444 例；平均年齡（25.39±12.04）歲；聽力正常的耳聾患者家庭人員299 例為耳聾高危組，男139 例，女160 例；平均年齡（28.38±15.23）歲；聽力正常的非耳聾患者家庭人員640 例為正常對照組，男288 例，女352 例；平均年齡（28.04±5.12）歲。904 例耳聾患者按地區分為蘇南、蘇中、蘇北三組，其中鎮江的254 例為蘇南組，男126 例，女128 例；平均年齡（24.26±12.53）歲，泰興、如皋、高郵的287 例為蘇中組，男153 例，女134 例；平均年齡（26.13±13.13）歲，漣水、沭陽的363 例為蘇北組，男181 例，女182 例；平均年齡（25.59±10.63）歲。耳聾組、耳聾高危組、正常對照組三組及蘇南、蘇中、蘇北三組的一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。所有研究對象自愿參加并簽署知情同意書。本研究通過江蘇省計劃生育科學技術研究所醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 資料收集及標本采集 收集所有研究對象的基本信息、耳聾家族史、是否耳聾、以及耳聾發病原因等資料。抽取外周靜脈血2～3 mL，EDTA 抗凝，冷鏈運輸至本實驗室后置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 基因組DNA 提取 采用血液基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP319]，按照標準操作流程提取全血基因組DNA，將經微型分光光度計（博奧晶芯NanoQTM）檢測DNA 濃度和純度均符合實驗要求的DNA 樣本置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.3 線粒體DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T 突變檢測 采用遺傳性耳聾基因微陣列芯片檢測試劑盒（博奧生物有限公司，貨號：CP300065）、PCR 擴增儀（ABI Veriti 96 well Thermal Cycler）、芯片雜交儀（晶芯BioMixerTMⅡ）、芯片洗干儀（晶芯SlideWasherTM24）、芯片掃描儀（晶芯LuxScan 10K-B）等儀器對受檢樣本的線粒體DNA 12S rRNA 兩個常見的突變位點A1555G 和C1494T 的突變檢測，所有試驗操作均嚴格按照SOP 進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗，計數資料采用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組線粒體DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T突變率比較

耳聾組、耳聾高危組、正常對照組三組的A1555G和C1494T 突變檢出率比較，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；耳聾組和耳聾高危組A1555G 和C1494T突變檢出率顯著高于正常對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；耳聾高危組與耳聾組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 三組線粒體DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T 的突變率比較[例（%）]

2.2 不同地區耳聾患者線粒體DNA 12S rRNA A1555G和C1494T 突變率比較

蘇南、蘇中、蘇北三組A1555G 和C1494T 突變率比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）；蘇北組A1555G和C1494T 突變率高于蘇中組和蘇南組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；蘇中組和蘇南組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 不同地區耳聾患者線粒體DNA 12S rRNA A1555G和C1494T 的突變率比較[例（%）]

2.3 耳聾患者發病原因分析

904 例耳聾患者中，40 例有氨基糖苷類抗生素用藥史，165 例有打針/用藥史但具體用藥不詳；109 例A1555G 和C1494T 位點突變的耳聾患者中，9 例有氨基糖苷類抗生素用藥史，31 例有打針/用藥史但具體用藥不詳。見表3。

表3 耳聾患者發病原因分析[例（%）]

3 討論

藥物性耳聾是指由氨基糖苷類藥物如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素誘發的一種非綜合征性遺傳性耳聾[9]，其主要的致病機制為藥物性耳聾基因線粒體DNA 12S rRNA 發生突變，其中最常見的突變位點為A1555G 和C1494T。A1555G 和C1494T 突變可使機體對線粒體蛋白的合成降低30%～40%，而氨基糖苷類抗生素的應用可在此基礎上進一步降低線粒體蛋白的合成[10]，導致氧化磷酸化過程中ATP 生成減少以及毛細胞能量代謝障礙，最終引起聽力下降甚至聽力喪失。另有研究表明，C1494T 突變雖然可引起線粒體功能的輕度障礙和對氨基糖苷類抗生素的高度敏感，但尚不足以導致耳聾的發生，提示核修飾基因、線粒體單體型以及氨基糖苷類抗生素的應用等對耳聾表型的表達起著重要的調節作用[11-12]。氨基糖苷類抗生素具有較大的毒副作用，可引起聽覺、前庭系統和腎臟不同程度的損傷[13]，其中對聽覺和前庭系統的損傷往往都是不可逆的[14]。因其抗菌譜廣、臨床起效快、價格低廉等特點，目前仍被應用于臨床，尤其是在發展中國家和一些偏遠地區，更是臨床的常規用藥之一[15]。

線粒體遺傳屬于母系遺傳，平均每檢測出一個線粒體DNA 12S rRNA 基因突變攜帶者，可以發現10 個甚至10 個以上的攜帶有相同突變位點、但未發生藥物性耳聾的母系家庭成員[16]。對于這些突變基因攜帶者，尤其是有生育計劃的孕前女性，突變基因會100%遺傳給下一代[17-18]。我國地域廣闊，各地經濟、衛生發展不均衡，且耳聾基因的分布類型以及分布頻率在不同地區、不同民族間也具有差異性[19]。

本研究發現耳聾患者中A1555G 和C1494T 突變檢出率為12.06%，明顯高于徐彬等[20]報道的5.63%和李守霞等[21]等報道的2.61%，其中主要的突變位點和突變類型為A1555G 均質突變（11.06%），可能與研究對象不完全相同有關；耳聾高危組突變檢出率為9.03%，均為A1555G 均質突變；正常對照組突變檢出率為0.31%，均為A1555G 位點均質突變，與趙艷輝等[22]、巫靜帆等[23]報道的數據相近。A1555G 和C1494T 突變具有母系遺傳的特點，先證者所有母系家庭人員均攜帶相同的基因突變位點和突變類型，而本研究的研究對象中既有散發病例，也有耳聾家系，其中有部分耳聾家系被證實為藥物性耳聾家系，其所有的母系家庭人員均攜帶相同的A1555G 均質突變[24-25]，從而導致A1555G 和C1494T 總的突變檢出率相對較高。不同地區耳聾基因突變檢出率不同，可能是耳聾基因的突變類型和突變頻率在不同地區之間有一定的地域差異；與蘇南、蘇中比較，蘇北經濟、衛生發展相對落后，對藥物性耳聾的防控知識的宣傳相對較少，在農村等偏遠地區氨基糖苷類抗生素應用頻率較高，導致部分突變基因攜帶者因誤用氨基糖苷類抗生素而導致聽力的損失。而在蘇南和蘇中地區，部分突變基因攜帶者可能因未接觸氨基糖苷類抗生素，其聽力仍然表現為正常或僅輕度異常。對耳聾患者和具有A1555G 和C1494T 位點陽性突變的耳聾患者的發病原因進一步分析，發現有氨基糖苷類抗生素用藥史的比例分別為4.42%、8.26%，部分有打針/用藥史但具體的藥物不詳（18.25%、28.44%），大部分人群發病原因不明或未報告發病原因，可能是本研究中氨基糖苷類抗生素用藥史比例較低的原因。

綜上所述，在江蘇地區人群中尤其是耳聾和耳聾高危人群中開展線粒體DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T 突變篩查，不僅可以為突變基因攜帶者提供及時的用藥指導，避免藥物性耳聾的發生或者加重已有的聽力損失程度，而且對有突變母親的子代亦可從新生兒期即開始采用有效的防控手段，終身避免使用氨基糖苷類抗生素，避免或推遲藥物性耳聾的發生以及“因聾致啞”現象的發生，對優生優育的開展、出生缺陷的防治以及全人口綜合素質的提高均具有重要的臨床意義和社會意義。