草果揮發油及其包合物GC-MS 成分分析及抑菌試驗研究

劉 娜 丁 雄 趙 毅 蘇劉艷 趙蓉羽

云南中醫藥大學中藥學院，云南昆明 650500

草果（Amomum tsaoko），是姜科豆蔻屬植物的果實，香味濃郁，具有燥濕健脾，除痰截瘧的功效。主治脘腹脹滿，反胃嘔吐，食積瘧疾等癥[1-3]。揮發油是草果主要活性成分之一[4]，但易揮發、易氧化、不穩定、水溶性差等缺點，限制了其在醫藥方面的應用[5]。本研究用β-環糊精（β-CD）將其制成包合物，增加穩定性，提高利用度[6]，掩蓋揮發油的異味[7-8]。本研究對草果揮發油及其包合物進行氣相色譜-質譜（GC-MS）成分分析，同時，進行相關抑菌活性研究，以期為草果的綜合開發利用提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子天平CP114（精密度0.1 mg，奧豪斯儀器上海有限公司）；SG8200HPT 型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；SHZ-CBZ 型循環水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；低溫冷卻液循環泵DLSB-20L/30（鞏義市予華儀器有限責任公司）；101-4AS 電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫療儀器廠）；FA2104 分析天平（精密度0.1 mg，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；HP6890GC/5973MS 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent Technologies 公司）。

1.2 試藥

草果[產地：怒江州，經云南中醫藥大學楊雅竹副教授鑒定為姜科植物草果（Amomum tsaoko）的干燥果實]。正己烷（分析純，廣東光華科技股份有限公司，20181221）。氟康唑分散片（南昌弘益藥業有限公司，181001）；DMSO（BioFRoxx，EZ2921C395）；沙氏液體培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，1076161）；沙氏固體培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，1076641）；亞甲藍M-H 瓊脂培養基（廣東環凱微生物科技有限公司，1081661）；LB 固體培養基（Solarbio，20190529）；瓊脂（Agar，BioFRoxx，EZ1609C222）；氯化鈉（分析純，天津風船化學試劑科技有限公司，20181203）。

1.3 培養基和菌株

①試藥：抗真菌活性檢測陽性對照藥物氟康唑溶于DMSO，離心取上清液，貯存濃度為50 mg/mL，4℃密封避光保存。②培養基：沙氏液體培養基、沙氏固體培養基、亞甲藍M-H 瓊脂培養基、LB 液體培養基、LB固體培養基。③菌株：白色念珠菌標準株SC5314、白色念珠菌臨床分離耐藥株23#（昆明醫科大學第一附屬醫院李玉葉惠贈）、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922。

2 方法與結果

2.1 草果揮發油的制備

采用水蒸氣蒸餾法提取草果揮發油[9-10]。精密量取揮發油0.5 mL，至10 mL 量瓶，加正己烷，定容至刻度，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，進行GC-MS分析。

2.2 草果揮發油包合物的制備

β-CD 為包合材料[11]，超聲法制備揮發油包合物。精密稱取包合物3 g 加100 mL 水超聲破壞30 min。置于圓底燒瓶中重提揮發油，精密量取揮發油0.5 mL，至10 mL 量瓶，加正己烷，定容至刻度，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，進行GC-MS 分析。

2.3 GC-MS 條件與結果

2.3.1 GC-MS 條件

2.3.1.1 GC 條件HP-5MS 石英毛細管柱（30 m×0.25mm×0.25 mm）；柱溫：起始溫度40℃，程序以3℃/min 升溫至80℃，再以5℃/min 升溫至280℃，保持5 min；柱流量為1.0 mL/min；進樣口溫度250℃；柱前壓100 kPa；進樣量1.0 mL；分流比10∶1；載氣為高純氦氣。

2.3.1.2 MS 條件 電離方式EI；電子能量70；傳輸線溫度250℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；質量范圍35～500；采用wiley7n.l 標準譜庫計算機檢索定性。

2.3.2 GC-MS 成分分析結果

參考文獻[12-14]對草果揮發油及其包合物進行GCMS 測試，2 種揮發油的總離子流（TIC）如圖1、2 所示。對2 種揮發油的GC-MS 成分分析，見表1。將各組分質譜數據由wiley7n.l 標準譜庫檢索并結合有關參考文獻[15-17]等，鑒定了60 個化合物，用峰面積歸一化法計算各成分在揮發油的相對百分含量。見表1。

草果揮發油分離出68 個化合物，鑒定68 個；草果包合物揮發油分離出64 個化合物，鑒定60 個。其中共有含量較高的主要成分有13 個序號分別為：14、10、40、44、4、6、54、30、37、42、47、63、51（按化合物占草果揮發油總化合物的含量從高到低排序），以上13 個化合物占總化合物比例分別為：占草果揮發油的81.03%；占草果包合物揮發油的79.89%。

草果揮發油包合前后60 個化合物未發生改變，分別占草果揮發油總化合物的99.11%，占草果包合物揮發油總化合物的99.65%。數據顯示揮發油經超聲包合處理后，99%以上的成分都包合進入β-CD中，形成穩定的包合物。

圖1 草果揮發油總離子流圖

圖2 草果包合物揮發油總離子流圖

揮發油中有8 個化合物經包合后CG-MS 未檢出序號分別是1、9、13、28、34、49、65、67，以上8 個化合物在草果揮發油中占總化合物的0.89%；草果包合物揮發油中有4 個成分占總化合物的0.35%，在原揮發油中未檢出，也未鑒定出。本研究推測原油中的8 個化合物可能在超聲作用下不穩定（如順式結構）轉化成其他更加穩定的結構[18]，或者是分子結構過大，沒有被包合。包合后的揮發油中未鑒定出的4 個化合物，有可能是原油中的化合物在超聲作用下發生結構轉化而產生的，本課題組將進行后續的相關研究。

2.4 抑菌試驗實驗方法與結果

2.4.1 抑菌試驗實驗方法K-B 法（標準濾紙片法）

①取純菌落，制備菌懸液，調整濃度為1×107CFU/mL，每個平板各加載菌液500 μL，立即用棉拭子均勻涂板，放置10 min 左右，待菌液完全吸收，用鑷子加載直徑為6 mm 的無菌濾紙片。②加載紙片后，取一定量的待測樣品（樣品為揮發油、和包合物重蒸后揮發油，均為液體狀）加載在濾紙片的正中心，防止抑菌圈畸形，待樣品均勻、完全的吸收后，放入恒溫恒濕箱中，孵育24 h 后，測量抑菌環的直徑。③在不反光的黑色背景下讀取抑菌圈的直徑，抑菌圈的直徑包括紙片的直徑。

2.4.2 揮發油抑菌活性實驗結果

針對草果具有燥濕健脾，除痰截瘧的功效，參考文獻資料[19-21]，本研究選擇了4 種菌種進行抑菌活性實驗，結果見表2：草果揮發油及其包合物對白色念珠菌標準株和耐藥株抑菌圈的直徑都已經超過整個培養皿（>40 mm），整個培養皿不長菌，有很好的抑菌效果，并且抑菌效果明顯優于氟康唑。對金黃色葡萄球菌抑菌效果較好；對大腸埃希菌有一定的抑菌效果。綜上所述，草果揮發油及其包合物對4 種菌種均有抑制作用，且包合前后的抑菌效果沒有顯著性的差異。

3 討論

采用水蒸氣蒸餾法[22]提取草果揮發油，β-CD 作為包合材料[23]，超聲法進行草果揮發油的包合，通過GC-MS 成分分析，揮發油99%以上的成分都包合進入β-CD 中，形成穩定的包合物。同時，包合前后的抑菌效果沒有顯著性的差異，再次佐證了包合物對揮發油成分進行物理包合，工藝穩定。本研究對β-CD 包合理論[24]提供實驗數據支持。草果揮發油及其包合物對白色念珠菌標準株以及耐藥株都很好的抑菌效果，可為云南省草果產業的發展[25]提供科學依據。

表1 草果揮發油和包合物的GC-MS 成分分析表

表2 草果揮發油和揮發油包合物抑菌活性實驗匯總表（mm）