乳清分離蛋白-葡聚糖糖基化條件優化及抗氧化活性

傅錫鵬，朱秀靈，戴清源*，洪青源，張偉偉，陳 錦，邱小晴，丁雅瑞

(1.安徽工程大學 生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000；2.微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖 241000)

乳清分離蛋白是奶酪制作的副產品，主要由β-乳球蛋白和α-乳清蛋白組成，具有良好的發泡性、膠凝性和保水性等功能特性，因此常被作為天然食品成分用于食品加工。但由于天然乳清分離蛋白在酸性條件下尤其在等電點附近時溶解度低，對環境pH值及熱處理條件高度敏感，限制了其在食品、醫藥、化妝品等領域的廣泛應用。

通過物理、化學和酶法處理均可改善蛋白質的功能特性，但其中的一些方法需要使用有毒的化學試劑，這將導致此類方法改性的蛋白質不能用作食品的原料。近年來報道較多的一種簡便、有效、天然、無毒的改善蛋白質功能特性的方法是糖基化反應，它是基于蛋白質的氨基與糖的還原端羰基發生的美拉德反應。根據反應體系狀態的不同，糖基化反應分為干熱糖基化和濕熱糖基化。干熱糖基化經常發生在干燥狀態的物料體系中，需要控制反應條件，并且反應時間較長，但由于反應效率較高，常被用于改善蛋白質的功能特性。濕熱糖基化是在溶液狀態下發生的，反應時間短，但在較高溫度下蛋白質會變性聚集，且溶液狀態會增加運輸成本。與單糖或雙糖相比，蛋白質與多糖形成的糖基化產物可顯著改善蛋白質的物理和化學性質，如熱穩定性、乳化性和抗氧化性，例如β-乳球蛋白與葡聚糖在60 ℃水分活度0.44條件下進行糖基化反應能夠顯著提高蛋白質的溶解度和熱穩定性。利用多糖(如葡聚糖、殼聚糖或半乳甘露聚糖)改善蛋白質(如卵清蛋白、溶菌酶、大豆蛋白和乳清蛋白)的功能特性已有大量文獻報道，其中大多數集中在蛋白質的熱穩定性和乳液穩定性。

利用糖基化反應改善乳清分離蛋白的抗氧化活性的研究亦有相關報道。Wang等研究發現乳清分離蛋白與木糖、葡萄糖、果糖等的糖基化產物均具有較高的抗氧化活性。美拉德反應產物的抗氧化能力除了來自最終產物類黑精外，中間產物、雜環化合物及還原酮等物質也具有一定的抗氧化活性。美拉德反應的進程、產物的結構及功能性質受許多因素的影響，除了糖和氨基化合物的種類、濃度外，反應溫度、時間、pH、相對濕度對其也有重要的影響。常用的抗氧化活性測定方法主要有DPPH(1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)自由基清除能力、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid))自由基清除能力、還原能力等，測定方法不同其結果會有較大差異，因此，需要用不同的方法多角度地評價糖基化產物的抗氧化活性。已有文獻報道，糖基化反應可提高乳清分離蛋白的抗氧化性能，有效清除自由基，達到抗衰老作用，也能對延緩心腦血管組織的老化發揮一定的作用，在食品、醫藥等領域有著巨大的開發利用前景。

基于此，研究以乳清分離蛋白和葡聚糖為原料，采用干熱糖基化反應制備糖基化蛋白，通過單因素試驗探討蛋糖比、反應溫度、反應時間和相對濕度對糖基化反應的影響。在此基礎上，通過響應面試驗優化糖基化反應條件，并對糖基化產物的pH穩定性、熱穩定性以及抗氧化活性進行研究，為乳清分離蛋白及其他可食用蛋白的綠色改性和合理利用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

乳清分離蛋白(Wheyproteinisolate，WPI)，購于上海江萊生物科技有限公司；鄰苯二甲醛(Ortho-phthalaldehyde,OPA)，購于上海瑞永生物科技有限公司；β-巰基乙醇，購于麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl，DPPH)、2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-Azinobis-(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid)，ABTS)，購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；葡聚糖(Dextran，Dex；其分子量為40 kDa)及其他常規試劑，均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要設備

FD-1A-50+型真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；DHG-9070型烘箱(成都晟杰科技有限公司)；UV-5800PC型分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

(1)乳清分離蛋白-葡聚糖糖基化反應。參照文獻[15]方法并稍作修改：將乳清分離蛋白和葡聚糖按照一定質量比混合并溶于超純水中，使乳清分離蛋白的質量濃度控制在40 mg/mL，磁力攪拌2 h，然后真空冷凍干燥得到凍干粉。再將凍干粉分別放入底部盛有能維持體系一定濕度的飽和鹽溶液的干燥器中，把干燥器置于干燥箱中預熱，以使糖基化反應保持在相對濕度和反應溫度相對穩定的狀態。通過控制乳清分離蛋白與葡聚糖的質量比(蛋糖比)、反應溫度和反應時間，分別得到不同接枝度的糖基化產物。

(2)單因素試驗。以接枝度為指標，研究蛋糖比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3 g/g(反應溫度80 ℃，反應時間48 h，相對濕度75%),反應溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃(蛋糖比1∶2 g/g，反應時間48 h，相對濕度75%),反應時間為24 h、48 h、72 h、96 h和120 h(蛋糖比1∶2 g/g，反應溫度80 ℃，相對濕度75%),相對濕度為干燥狀態、25%、50%、75%、100%(蛋糖比1∶2 g/g，反應溫度80 ℃，反應時間72 h)對乳清分離蛋白-葡聚糖糖基化反應的影響。其中，體系相對濕度分別采用飽和的氯化鎂、溴化鈉和氯化鈉溶液以及超純水，置于干燥器中密封，以控制體系相對濕度分別為25%、50%、75%、100%，以PO代替飽和鹽溶液以控制干燥器為極低相對濕度即干燥狀態。

(3)響應面試驗。在單因素試驗的基礎上，根據中心組合試驗設計原理，選擇蛋糖比、反應溫度、反應時間和相對濕度4個因素，各設置3個水平，以接枝度為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計并優化制備條件。響應面試驗設計因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平

(4)接枝度測定。接枝度的測定采用鄰苯二甲醛(OPA)法，精確稱取40 mg OPA溶解于1 mL甲醇中，分別加入2.5 mL(20% w/w)十二烷基硫酸鈉溶液、25 mL(0.1 mol/L)硼砂溶液和100 μL β-巰基乙醇，混勻后加入去離子水定容至50 mL，得到OPA溶劑(現用現配)。分別移取4 mL OPA溶液加入到200 μL稀釋至適當濃度的樣品溶液中，混勻后于35 ℃水浴保溫2 min，以去離子水作為空白對照，用紫外分光光度計于340 nm處測定吸光度值。以賴氨酸為標準，獲得自由氨基摩爾濃度與吸光度值之間的線性回歸曲線(

A

=0

.

459 9

C

+0

.

094 5，

R

=0

.

999 5，線性范圍為0.17～1.71 mmol/L)。按式(1)計算糖基化產物的接枝度(Degree Ofgrafting，DG)。

(1)

式中,

DG

為接枝度(%)；

C

為未進行糖基化反應樣品溶液中自由氨基基團的毫摩爾濃度(mmol/L)；

C

為反應

t

時糖基化樣品溶液中自由氨基基團的毫摩爾濃度(mmol/L)。(5)溶解度測定。蛋白質及其糖基化產物的溶解度采用考馬斯亮藍G250染色法測定，以牛血清白蛋白為標準品，測定波長為595 nm，得到吸光度(

Y

)與牛血清白蛋白濃度(

X

)之間的標準曲線

Y

=0

.

150 8

X

-0

.

002 2(

R

=0

.

999 2)，線性范圍為0～1 mg/mL。將待測樣品分別溶解于去離子水中并調整蛋白質濃度為2 mg/mL，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH溶液分別調節溶液pH為2.0、3.0、4.0、4.8、5.0、5.2、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，再補加去離子水使蛋白質濃度為0.2 mg/mL，室溫磁力攪拌30 min，離心(8 000 r/min，30 min)，分別移取1 mL上清液置于不同的試管中，各加入5 mL考馬斯亮藍G250溶液并混勻，靜置2 min后于595 nm波長下測定吸光度值。根據標準曲線計算上清液中蛋白質的濃度(

C

)，根據式(2)計算待測樣品中蛋白質的溶解度(

S

)。

(2)

式中，

S

為待測樣品中蛋白質的溶解度(%)；

C

為通過上清液中蛋白質的質量濃度(mg/mL)；

V

為上清液的體積(mL)；

m

為待測樣品中蛋白質的質量(g)；10為質量單位換算數值。

(6)穩定性測定。參照文獻[20]采用濁度法測定乳清分離蛋白及其糖基化產物的熱穩定性和pH穩定性。分別稱取一定質量的待測樣品，加入適量去離子水在磁力攪拌下溶解1 h，分別采用1 mol/L HCl或NaOH溶液調節pH為2.0、3.0、4.0、4.8、5.0、5.2、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，用去離子水調整蛋白質濃度為2 mg/mL，分別于室溫和85 ℃處理15 min，再利用紫外可見分光光度計測定溶液在633 nm波長處的吸光度值，以去離子水為空白對照。

(7)DPPH自由基清除能力測定。參照文獻[21-22]方法并修改如下：量取1 mL(0.1 mmol/L)DPPH(體積分數95%乙醇溶解)溶液加入到3.0 mL(1 mg/mL)待測樣品中，混勻，室溫暗處靜置30 min，離心(4 000 r/min，10 min)，取上清液于517 nm處測定吸光度值，以體積分數95%乙醇代替DPPH的樣品溶液為對照品，以體積分數95%乙醇代替樣品溶液作為空白，DPPH自由基清除率以式(3)計算。

(3)

式中,

A

為樣品溶液的吸光度值；

A

為對照品溶液的吸光度值；

A

為空白溶液的吸光度值。

(8)ABTS自由基清除能力測定。參照文獻[23]測定ABTS自由基清除能力。向ABTS溶液(7.4 mmol/L)中加入過硫酸鉀溶液2.6 mmol/L，并將混合物在黑暗中儲存18 h來形成ABTS儲備溶液。用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋ABTS儲備溶液，直至其在734 nm處吸光度值為0.7±0.2。然后，將樣品與ABTS稀釋液以1∶19(v/v)比例混合；在空白對照中加入去離子水來代替樣品。將混合物離心(4 000 r/min，10 min)以除去不溶性蛋白質，并測量混合物在734 nm波長處的吸光度值。ABTS自由基清除率采用式(4)計算。

(4)

(9)還原能力測定。還原能力測定采用文獻[3]方法：1 mL樣品(蛋白質含量為2 mg/mL)與1.0 mL 0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.6)和1.0 mL質量分數為1%鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃水浴保溫20 min，冷卻至室溫后加入1.0 mL質量分數為10%三氯乙酸溶液，混勻，離心(4 000 r/min，10 min)，移取上清液2 mL，加入2.0 mL去離子水及0.4 mL質量分數為0.1%FeCl溶液，混勻，于700 nm波長處測定溶液的吸光度值(以去離子水作為空白溶液)。結果以3次重復實驗的平均值表示。

1.4 數據處理

實驗重復3次，結果以平均值±標準偏差表示。采用Origin 2018繪制折線圖及柱形圖，采用Design Expert 8.0.5軟件進行響應面分析和響應面圖繪制，采用IBM SPSS Statistics Version 20軟件對數據進行相關性和差異顯著性分析，

P

<0

.

05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

(1)蛋糖比對糖基化反應的影響。蛋糖比即乳清分離蛋白與葡聚糖質量比，其對糖基化反應的影響如圖1所示。由圖1可知，在乳清分離蛋白和葡聚糖的混合體系中，隨著葡聚糖所占比例的增加，接枝度逐漸增加，當蛋糖比為1∶2 g/g時，糖基化產物接枝度達到最大值(20.14%)。但隨著葡聚糖所占比例進一步增加，接枝度反而下降。這可能是由于體系中多糖所占比例的增加提高了蛋白質與多糖分子的碰撞機會，進而提高了糖基化反應的速率和接枝效果；但是隨著體系中葡聚糖所占比例的繼續增加，蛋白質和葡聚糖的空間位阻作用也隨之增強，當乳清分離蛋白與葡聚糖質量比小于1∶2 g/g時，分子流動性降低，空間位阻作用阻礙了乳清分離蛋白和葡聚糖的相互接觸。因此，乳清分離蛋白與葡聚糖的質量比以1∶2 g/g為宜。

(2)反應溫度對糖基化反應的影響。反應溫度對糖基化產物接枝度的影響如圖2所示。由圖2可以看出，反應溫度對糖基化反應有顯著性影響(

P

<0

.

05)，接枝度的大小與溫度的高低正相關，溫度升高，接枝度增加。這主要是由于較高的溫度能夠加速分子運動，增大蛋白質和多糖分子之間的碰撞概率，有助于糖基化反應。此外，在一定溫度范圍內，隨著溫度的升高，蛋白質分子結構打開，蛋白質分子內部的自由氨基暴露出來，易與葡聚糖的羰基發生糖基化反應，使接枝度增加。由圖2還可以看出，在60～70 ℃之間，接枝度增加速度最快，隨后接枝度也顯著增加但增幅減緩，可能是由于蛋白質分子上共價結合的糖鏈增長，空間位阻效應使糖基化反應受到限制。當溫度高于90 ℃，接枝度增加不顯著。此外，在較高溫度下，糖基化反應的能耗增大，還可能導致某些特殊的色素物質產生。綜合考慮，反應溫度以70～90 ℃為宜。

圖1 乳清分離蛋白與葡聚糖質量比對糖基化產物接枝度的影響 圖2 反應溫度對糖基化產物接枝度的影響圖1注：不同字母表示差異顯著(P<0.05),下圖同。

(3)反應時間對糖基化反應的影響。在一定溫度下，反應時間是影響糖基化反應的重要因素之一。反應時間對糖基化產物接枝度的影響如圖3所示。由圖3可知，在反應的起始階段(24～48 h)，糖基化產物接枝度隨著反應時間的延長而顯著性增加(

P

<0

.

05)；當反應時間在48～72 h內，接枝度顯著性增加但增幅減緩；當反應時間超過72 h后，接枝度增加不顯著，這與文獻[27-28]報道基本一致。這可能是由于反應起始階段乳清分離蛋白分子含量較高，糖基化蛋白接枝度增加迅速；隨著糖基化反應持續進行，未反應的乳清分離蛋白含量降低，反應速度降低，當可獲得的自由氨基基本反應完全后，其接枝度將不再增加；此外，反應時間超過某一限定值時，還可能導致某些特殊的色素物質產生，因此，反應時間以72 h為宜。

(4)相對濕度對糖基化反應的影響。相對濕度對糖基化反應的影響如圖4所示。由圖4可以看出，在干燥狀態即相對濕度較低的條件下，乳清分離蛋白與葡聚糖糖基化產物的接枝度較低(13.86%±0.01%)；與干燥狀態相比，在相對濕度25%～100%時，接枝度均顯著增加；當相對濕度為25%～100%時，接枝度變化差異不顯著。其原因可能是在干燥狀態下體系的相對濕度較低，蛋白質具有相對靜止的結構，多肽鏈移動受限。隨著相對濕度的不斷增加，水分含量不斷增多，通過水合作用和穿透作用可以使蛋白質溶脹結構膨松，蛋白質多肽鏈的移動性和柔性增強，促進乳清分離蛋白與葡聚糖之間的相互作用，從而使接枝度增加。但相對濕度進一步增加，也會使多肽鏈移動過快不利于糖基化反應，從而使接枝度不再提高。由圖4還可以得知，保持體系處于一定的相對濕度狀態，有助于促進乳清分離蛋白和葡聚糖之間的糖基化接枝反應，增大或減少相對濕度(干燥狀態除外)對糖基化接枝反應不會產生顯著性影響。綜合考慮，相對濕度以25%～75%為宜。

圖3 反應時間對糖基化產物接枝度的影響 圖4 相對濕度對糖基化產物接枝度的影響圖4注：以P2O5代替飽和鹽溶液控制極低相對濕度即干燥狀態；以氯化鎂、溴化鈉、氯化鈉的飽和鹽溶液以及超純水控制體系相對濕度分別為25%、50%、75%和100%。

2.2 響應面試驗與設計

(1)回歸模型的建立及分析。在單因素試驗的基礎上，選取蛋糖比、反應時間、反應溫度、相對濕度4個因素進行Box-Behnken試驗設計，結果如表2和表3所示。采用Design Expert 8.0.5軟件對表2中的數據進行二次回歸擬合分析，得到回歸模型如下：

Y

(%)=22

.

59-0

.

76

A

+2

.

89

B

+3

.

29

C

-0

.

38

D

+0

.

15

AB

-0

.

22

AD

+0

.

34

BC

-0

.

24

BD

+2

.

09

CD

-0

.

50

A

-1

.

63

B

-0

.

34

C

+0

.

96

D

。

(2)響應面圖的分析與優化。采用Design Expert 8.0.5軟件對表2中的數據進行解析，可得到乳清分離蛋白和葡聚糖糖基化反應的響應面圖如圖5所示。由圖5a可知，在反應時間和相對濕度不變時，隨著蛋糖比中葡聚糖含量增加和反應溫度升高，接枝度逐漸增大至最大值24.07%；由圖5b可以看出，在反應溫度和相對濕度相對恒定情況下，隨著蛋糖比中葡聚糖含量增加和反應時間延長，接枝度逐漸增大并達到最大值25.67%；由圖5c得知，當其他反應條件不變并維持體系相對濕度在同一水平時，隨著蛋糖比中葡聚糖含量增加，接枝度逐漸增大并達到最大值，然后再逐漸降低；當其他反應條件不變并且蛋糖比中葡聚糖含量相同時，隨著相對濕度增大，接枝度先逐漸降低而后逐漸增加；圖5d表明升高反應溫度和延長反應時間(其他反應條件不變)能夠提高乳清分離蛋白和葡聚糖糖基化產物的接枝度；圖5e說明在其他反應條件不變且反應時間達到某一值時，增大相對濕度，接枝度增加；同樣地，相對濕度恒定不變，隨著反應時間的延長，接枝度也增大。由此說明各因素交互作用對接枝度具有不同程度的影響。

在此基礎上，通過Design-Expert 8.0.5軟件對回歸方程求極值，得出

A

=0

.

93，

B

=88

.

72，

C

=72，

D

=75，在此條件下乳清分離蛋白與葡聚糖糖基化產物的接枝度的理論值能達到29.94%。為驗證響應面優化結果的可靠性，兼顧實際操作可行性，將最佳反應條件修正為蛋糖比1∶1.05(g/g)，反應溫度85 ℃，反應時間72 h，相對濕度75%，在此條件下重復實驗3次，實際測得的接枝度平均值為26.34%±0.38%，達到預測值的87.98%，進一步驗證了該理論模型的可行性。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

2.3 乳清分離蛋白及其糖基化產物的溶解度

乳清分離蛋白及其糖基化產物在pH 2.0～10.0范圍內的溶解度如圖6所示。由圖6可以看出，蛋白質及其糖基化產物的溶解度隨著pH值的變化而有不同程度的變化，在pH 2.0～10.0范圍內時，乳清分離蛋白的溶解度最小，其中以pH 4.8時溶解度最小，為32.99%±2.58%；與乳清分離蛋白相比，糖基化產物的溶解度均較高，在pH 4.8附近時，其溶解度增加更為明顯，并且隨著糖基化反應時間延長而逐漸增大；在反應0 h、24 h、48 h和72 h時，糖基化產物的溶解度分別為50.58%±5.31%(pH 4.8)、79.76%±1.55%(pH 4.8)、87.62%±2.82%(pH 5.2)、90.10%±0.94%(pH 5.0)，分別是pH 4.8時乳清分離蛋白溶解度的1.53、2.42、2.66和2.73倍。馮玉超等研究發現蕓豆蛋白及其糖基化蛋白的溶解度均呈先下降后上升的趨勢，在等電點附近時，糖基化蛋白的溶解度約為蕓豆蛋白自身溶解度的兩倍，本研究與此報道一致。乳清分離蛋白的等電點在pH 5.0附近，當溶液的pH與蛋白質的等電點接近時，蛋白質的溶解度就會顯著降低，將多糖鏈通過糖基化反應共價接枝到蛋白質分子上，親水性多糖側鏈增加了蛋白質的親水性，所以乳清分離蛋白與葡聚糖的糖基化產物在等電點附近的溶解度高于乳清分離蛋白。此外，乳清分離蛋白與葡聚糖分子通過糖基化反應形成共價接枝物，由于葡聚糖分子空間大且親水性強，其空間位阻效應使蛋白質分子無法聚集，在一定程度上提高了乳清分離蛋白的溶解性。

表3 方差分析表

圖5 因素交互作用對接枝度的影響注：各因素水平以編碼值表示，接枝度(%)以實際測定結果表示。

2.4 乳清分離蛋白及其糖基化產物的穩定性

乳清分離蛋白及其糖基化產物的體系穩定性在外觀上表現為溶液是否存在聚集狀態，這種狀態可以通過測定溶液的濁度來判斷，濁度越大說明體系越不穩定，濁度越小說明體系越穩定。乳清分離蛋白及其糖基化產物25 ℃和85 ℃時在不同pH條件下的穩定性如圖7所示。由圖7可以看出，在pH 2.0～4.0和pH 6.0～10.0范圍內，溶液濁度較低且穩定，而在pH 4.0～6.0范圍內，溶液濁度因乳清分離蛋白糖基化反應時間不同而有較大差異，尤其在pH 5.0附近；與相同溫度下不同糖基化產物相比，乳清分離蛋白溶液的濁度最大，其體系最不穩定；其次，反應時間越短的糖基化產物，其濁度越高，且溫度越高濁度越大。由圖7可知，乳清分離蛋白及其糖基化產物在較高溫度下不穩定，與乳清分離蛋白相比，糖基化產物在pH 2.0～10.0范圍內均表現良好的pH穩定性和熱穩定性，且糖基化反應時間越長，得到的糖基化產物的pH穩定性和熱穩定性均越高。

圖6 乳清分離蛋白及其糖基化產物的溶解度 圖7 乳清分離蛋白及其糖基化產物25 ℃和85 ℃時在不同pH條件下的穩定性圖6注：WPI：乳清分離蛋白；WPI-Dex-0 h、WPI-Dex-24 h、WPI-Dex-48 h、WPI-Dex-72 h分別為乳清分離蛋白與葡聚糖糖基化反應0 h、24 h、48 h和72 h時的糖基化產物。圖7注：WPI-Dex-0 h、WPI-Dex-24 h、WPI-Dex-48 h、WPI-Dex-72 h分別為乳清分離蛋白與葡聚糖糖基化反應0 h、24 h、48 h和72 h時的產物。

2.5 DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力

乳清分離蛋白與葡聚糖在不同反應時間的糖基化產物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力如圖8所示。由圖8可以看出，糖基化產物清除ABTS陽離子自由基能力的變化趨勢與其清除DPPH自由基的變化趨勢相似，這是由于ABTS陽離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力都反映了樣品的供氫能力。由圖8還可以看出，所有測試樣品均具有一定的清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力，清除率由低到高依次為WPI-Dex-0 h、WPI-Dex-24 h、WPI-Dex-48 h、WPI-Dex-72 h，由此得知DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力與糖基化反應時間有關，且隨著糖基化反應時間延長(在其他條件相同的情況下)而顯著性增加(

P

<0

.

05)；當反應時間由24 h增加至48 h時，糖基化產物對DPPH和ABTS自由基清除率的變化幅度最大，但進一步延長反應時間，自由基清除率增幅趨緩。已有大量研究表明蛋白質與糖分子反應生成的美拉德反應產物可作為氫供體與DPPH自由基形成穩定的DPPH-H分子，進而表現出良好的清除DPPH自由基的能力。但由于蛋白質分子在高溫下不穩定，高溫糖基化反應時間越長，蛋白質分子不穩定組分所占比例增加，作為氫供體的蛋白質分子減少，故導致DPPH自由基和ABTS自由基清除率在一定的反應時間后增加幅度減緩。

2.6 還原能力

還原能力可作為抗氧化活性的重要指標。還原能力的測定是根據樣品溶液中的還原劑能將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，進一步與三氯化鐵反應生成普魯士藍，此時樣品溶液在700 nm波長處具有最大吸收值，吸收值越大代表樣品的還原能力越強。乳清分離蛋白與葡聚糖在不同反應時間的糖基化產物的還原能力如圖9所示。由圖9可以看出，隨著糖基化反應程度的增加，糖基化產物的還原能力呈增大趨勢，其中，0～48 h時的糖基化產物的還原能力增加顯著(

P

<0

.

05)，其后糖基化產物的還原能力增加已不顯著(

P

<0

.

05)。

DAGLIA等提出，糖基化產物是一種特別復雜的混合物，由許多不同分子量的化合物組成，尤其是高分子量的化合物，這些高分子量化合物是美拉德反應高級階段的聚合產物，對抗氧化活性起著主要作用。此外，這些高級糖基化產物的羥基可能在其還原活性中發揮重要作用。另外，糖基化反應的中間產物還原酮類化合物能夠作為氫供體，阻斷自由基鏈式反應，使糖基化產物表現出較強的還原能力。研究中糖基化產物的還原能力與文獻[22]報道一致，與DPPH自由基和ABTS自由基清除能力變化趨勢相似，初步表明乳清分離蛋白與葡聚糖的糖基化產物具有一定的抗氧化活性。

圖8 乳清分離蛋白與葡聚糖糖基化產物對 圖9 乳清分離蛋白與葡聚糖糖基化 DPPH和ABTS自由基的清除能力 產物的還原能力圖8注：不同小寫字母表示DPPH自由基清除率差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示ABTS自由基清除率差異顯著(P<0.05)；WPI-Dex-0 h、WPI-Dex-24 h、WPI-Dex-48 h、WPI-Dex-72 h、WPI-Dex-96 h、WPI-Dex-120 h分別為乳清分離蛋白與葡聚糖糖基化反應0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h時的產物。圖9注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)；WPI-Dex-0 h、WPI-Dex-24 h、WPI-Dex-48 h、WPI-Dex-72 h、WPI-Dex-96 h、WPI-Dex-120 h分別為乳清分離蛋白與葡聚糖糖基化反應0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h時的產物。

3 結論

通過單因素試驗探討了蛋糖比、反應溫度、反應時間及相對濕度對乳清分離蛋白與葡聚糖糖基化反應的影響，在此基礎上，利用響應面試驗優化得到糖基化反應的最優工藝條件；與乳清分離蛋白相比，乳清分離蛋白糖基化產物表現出較好的溶解性、pH穩定性和熱穩定性，以及較高的清除DPPH、ABTS自由基能力和還原能力；在一定的反應時間范圍內，隨著糖基化反應時間延長，所得到的糖基化產物的溶解度、pH穩定性和熱穩定性均越高，其抗氧化活性也越強。利用食品成分如多糖、多酚及油脂對乳清分離蛋白進行改性以提高乳清分離蛋白的功能特性及抗氧化活性，提高乳清分離蛋白在食品中的應用具有非常重要的意義，但還需要進一步深入研究乳清分離蛋白糖基化產物的綠色制備技術，尤其是對熱和pH穩定的糖基化蛋白的綠色制備及其對食品功能因子穩態化、控釋及安全評價的研究。