虎杖苷通過調控Nrf2／HO-1 信號通路減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷

徐志廣，張樸花

（南華大學附屬南華醫院，湖南衡陽 421002）

肝臟缺血再灌注（hepatic ischemia-reperfusion，HIR）是肝臟切除或肝移植手術過程中不可避免的情況，其引起的損傷至今仍是一個重要的醫學問題。已有研究表明［1］，炎癥和氧化應激參與缺血再灌注損傷的發病機制，因此采用抗炎和抗氧化藥物治療HIR 損傷或許是一種有效的治療策略。虎杖苷是從虎杖根中提取的天然二苯乙烯類化合物，具有抗氧化、抗炎、改善微循環等多種藥理活性［2］。研究證實［3］，虎杖苷能通過發揮抗氧化和抗炎作用改善多器官的缺血再灌注損傷。然而，虎杖苷是否對HIR 誘導的肝損傷也有改善作用目前報道較少。核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是一種氧化還原反應性轉錄因子，是細胞內穩態的主要調節因子，調控一系列抗氧化蛋白表達。此外，Nrf2 還被認為是防治肝病的關鍵治療靶點［4］。因此，本研究擬通過干預Nrf2／HO-1 信號通路探討虎杖苷對HIR誘導的肝損傷的保護作用并初步闡明其作用機制，以期為虎杖苷應用于臨床改善HIR 損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體（SPF）級雄性SD 大鼠40 只，鼠齡6～7 周，體質量220～250 g，購自湖南昭泰生物醫藥有限公司，動物許可證編號SYXK（湘）2017-0004。動物飼養條件為分籠飼養，飼養溫度為20～23 ℃，相對濕度70%，光照周期12／12 h，自由飲水攝食。

1.2 試劑 虎杖苷（批號P1878，純度＞98%）購自南京春秋生物工程有限公司；Nrf2 抑制劑ML385（批號HY-100523，純度99.55%）購自美國Med-ChemExpress 公司；大鼠血清谷丙轉氨酶（批號SBJ-M0650，alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒和天冬氨酸轉氨酶（批號SBJ-M0078，aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司；丙二醛（批號A003-1-1，malondialdehyde，MDA）水平檢測試劑盒和超氧化物歧化酶（批號A001-3-2，superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（批號E09-301，tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（批號E10-01，interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素6（批號E07-1131，interleukin-6，IL-6）ELISA檢測試劑盒均購自美國Ebioscience 公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（批號C1091）購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗Bcl-2 多克隆抗體（批號GR190314-1）、兔抗Bax 單克隆抗體（批號GR181216-2）、兔抗cleaved caspase-3 多克隆抗體（批號GR190404-1）、兔抗Nrf2 單克隆抗體（批號GR190211-2）、兔抗HO-1 多克隆抗體（批號GR181207-1）、兔抗β-actin 多克隆抗體抗體（批號GR190424-2）和兔抗lamin B1 單克隆抗體（批號GR190307-1）及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG（批號GR190123-2）均購自英國Abcam 公司。

1.3 造模及分組 將SD 大鼠適應性飼養7 d 后，腹腔注射戊巴比妥（50 mg／kg）進行麻醉，然后進行中線剖腹術，再用血管夾夾持肝臟左側門靜脈支，造成70% 的肝臟缺血，觀察到肝正中葉和左側葉表面顏色由紅變灰白，提示缺血成功。缺血45 min 后取夾，再灌注6 h，灌注時之前灰白的肝臟組織顏色變紅。完成再灌注后，收集主動脈血液標本，并處死大鼠切除部分肝臟組織進行后續實驗。采用隨機數字法將40 只SD 大鼠分為5 組（每組8 只）為假手術組、模型組、低劑量虎杖苷組、高劑量虎杖苷組、高劑量虎杖苷聯合Nrf2 抑制劑組。假手術組大鼠僅麻醉后開腹，不阻斷肝臟血流，其余4 組均建立HIR 模型，并且低劑量虎杖苷組和高劑量虎杖苷組大鼠在造模前連續3 d 分別腹腔注射10、40 mg／kg 虎杖苷，每日1 次；高劑量虎杖苷聯合Nrf2 抑制劑組大鼠在高劑量虎杖苷組給藥處理方式的基礎上再給予腹腔注射30 mg／kg ML385，每日1 次；假手術組和模型組大鼠分別給予等體積生理鹽水。

1.4 血清指標檢測 將血液樣品于4 ℃下5 000×g離心5 min，取血清，采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分別檢測血清ALT 和AST 活性以及血清TNF-α、IL-1β和IL-6 水平。

1.5 肝組織氧化應激指標檢測 取肝左葉組織約1 mm3大小，加入適量（1 ∶10）組織蛋白抽提液，冰浴條件下充分碾碎，于4 ℃下12 000×g 離心20 min，取上清液按照試劑盒說明書加入相應試劑，37 ℃孵育10 min，采用酶標儀測定各樣品吸光度值，根據標準曲線分別計算肝組織中SOD 活性和MDA 水平。

1.6 肝組織HE 染色 取部分肝左葉組織并置于10%中性福爾馬林緩沖液中固定24 h，將固定好的肝組織制成石蠟切片，經二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇復水，蘇木精-伊紅染色后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織病理學改變。病理評分方法［5］為在顯微鏡下選擇10 個視野，觀察細胞核固縮、空泡形成、細胞質染色消失、細胞核消失、紅細胞淤積以及炎性細胞浸潤情況，根據病理學改變所占視野百分比計分，0 記0 分，0～10%記1 分，10%～50%記2 分，50%～100%記3 分。對6 項病理改變評分總和進行統計分析。

1.7 肝組織TUNEL 染色 取石蠟切片，經二甲苯脫蠟，濃度梯度乙醇復水，加入蛋白酶K 于室溫條件下孵育10 min，PBS 洗滌3 次，加入3% H2O2溶液室溫孵育10 min，滴加生物素標記液于37 ℃避光孵育30 min，PBS 洗滌3 次，滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，室溫避光孵育15 min，蘇木精復染，濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下可觀察陽性細胞呈棕褐色。于高倍鏡下每張切片選擇5 個隨機視野統計500 個細胞，以陽性細胞數目占統計的總細胞數目百分比表示細胞凋亡率。

1.8 Western Blot 檢測相關蛋白表達 將肝組織剪成小塊，加入RIPA 裂解液，冰上充分碾磨30 min，12 000×g 離心20 min，取上清液即為所提取蛋白溶液。另取部分肝組織，根據核蛋白提取試劑盒說明書提取組織細胞核蛋白，均采用BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 蛋白沸水浴變性后，進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，加入5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，1×TBST 洗滌3 次，加入一抗cleaved caspase-3（1 ∶1 000）、Bax（1 ∶1 000）、Bcl-2（1 ∶1 000）、Nrf-2（1 ∶500）、HO-1（1 ∶1 000），β-actin（1 ∶2 000）和lamin B1（1 ∶1 000），置于4 ℃孵育過夜。用1×TBST 洗滌3 次后加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h，1×TBST 清洗3 次，加入增強化學發光劑ECL 孵育1 min，曝光顯影。采用Image J 測定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.9 統計學分析 采用SPSS 22.0 分析軟件統計分析數據，數據以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析法進行分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗進行分析。 P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST 活性及肝組織病理學變化 如表1 所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清ALT 和AST 活性均升高（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠血清ALT 和AST活性均降低（P＜0.01），而低劑量虎杖苷組無明顯變化（P＞0.05）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯合Nrf2 抑制劑組大鼠血清ALT 和AST 活性又升高（P＜0.01）。HE 染色結果（圖1）顯示，假手術組大鼠肝組織細胞形態正常，無明顯充血腫脹，未見炎性細胞浸潤；模型組和低劑量虎杖苷組大鼠肝組織內可見大量細胞核固縮，細胞呈空泡樣，局部充血腫脹，大量炎性細胞浸潤以及肝細胞壞死；與假手術組比較，模型組病理評分升高（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠肝組織僅有少量細胞核固縮，局部充血腫脹得到明顯緩解，且有少量炎性細胞浸潤及細胞壞死，病理評分明顯降低（P＜0.01）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯合Nrf2 抑制劑組大鼠肝組織又出現大量細胞核固縮和細胞壞死，有大量炎癥細胞浸潤，病理評分明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠ALT、AST 活性比較（，n＝8）Tab.1 Comparison of ALT and AST activities in rats among various groups（，n＝8）

表1 各組大鼠ALT、AST 活性比較（，n＝8）Tab.1 Comparison of ALT and AST activities in rats among various groups（，n＝8）

注：與假手術組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與高劑量虎杖苷組比較，△△P＜0.01。

圖1 各組大鼠肝組織病理觀察（HE 染色，×400）Fig.1 Pathological observation of liver tissues of rats in various groups（HE staining，×400）

2.2 各組大鼠血清炎癥因子及肝組織氧化應激水平變化 如表2～3 所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平以及肝組織MDA 水平均增加（P＜0.01），而肝組織SOD 活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平以及肝組織MDA 水平均降低（P＜0.01），肝組織SOD 活性增加（P＜0.01），而低劑量虎杖苷組則無明顯變化（P＞0.05）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯合Nrf2 抑制劑組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平以及肝組織MDA 水平增加（P ＜0.01），而肝組織SOD 活性降低（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠肝組織細胞凋亡水平 TUNEL 染色（圖2）顯示，與假手術組比較，模型組大鼠肝組織細胞凋亡率增加（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠肝組織細胞凋亡率降低（P ＜0.01），而低劑量虎杖苷組無明顯變化（P ＞0.05）；與高劑量虎杖苷比較，高劑量虎杖苷聯合Nrf2 抑制劑組肝組織細胞凋亡率增加（P＜0.01）。Western blot（圖3）顯示，與假手術組比較，模型組大鼠肝組織Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達升高（P＜0.01），而Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠肝組織Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達降低（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達增加（P＜0.01），而低劑量虎杖苷組無明顯變化（P＞0.05）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯合Nrf2 抑制劑組大鼠肝組織Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達增加（P ＜0.01），而Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，n＝8）Tab.2 Comparison of serum levels of inflammatory factors in rats among various groups（，n＝8）

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，n＝8）Tab.2 Comparison of serum levels of inflammatory factors in rats among various groups（，n＝8）

注：與假手術組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與高劑量虎杖苷組比較，△△P＜0.01。

表3 各組大鼠肝組織氧化應激因子活性水平比較（，n＝8）Tab.3 Comparison of levels of liver oxidative stress factors in rats among various groups（，n＝8）

表3 各組大鼠肝組織氧化應激因子活性水平比較（，n＝8）Tab.3 Comparison of levels of liver oxidative stress factors in rats among various groups（，n＝8）

注：與假手術組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與高劑量虎杖苷組比較，△△P＜0.01。

圖2 各組大鼠肝組織細胞凋亡觀察（TUNEL 染色，×400）Fig.2 Observation of apoptosis of rat liver tissue cells in various groups（TUNEL staining，×400）

2.4 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達 如圖4 所示，與假手術組比較，模型組大鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達升高（P ＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達升高（P＜0.01），而低劑量虎杖苷組無明顯變化（P＞0.05）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯合Nrf2 抑制劑組大鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

HIR 是影響肝移植和肝切除術后肝功能的一個主要因素［6］。HIR 的發病機制涉及多種因素，包括氧化應激、線粒體損傷、趨化因子的產生等［7］。本研究通過阻斷肝血流45 min，再灌注6 h，引起HIR 損傷，結果表現為血清ALT 和AST 活性升高，肝損傷范圍從肝竇淤血腫脹到肝細胞壞死。這些結果與先前的研究結果一致［8-9］。表明成功構建了大鼠HIR 模型。

圖3 虎杖苷對Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達的影響Fig.3 Effects of polydatin on protein expressions of Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3

圖4 虎杖苷對HIR 大鼠Nrf2／HO-1 信號通路激活的影響Fig.4 Effects of polydatin on activation of Nrf2／HO-1 signaling pathway in HIR injury

虎杖苷作為從中藥虎杖根中分離出來的有效活性成分，具有抗氧化和抗炎活性［10］。已有研究提出虎杖苷對肝損傷具有保護作用，通過抑制氧化應激和炎癥反應，防治非酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化［11-12］。另外，虎杖苷還能通過抑制細胞凋亡改善對乙酰氨基酚藥物誘導的肝毒性［13］。這些研究說明，虎杖苷通過抗氧化和抗炎對多種因素引起的肝損傷具有保護作用。另有研究證明虎杖苷對包括心臟，大腦和腎臟在內的多器官缺血再灌注損傷的治療作用［3］。結合虎杖苷對肝損傷的保護作用，可以假設虎杖苷能改善HIR 誘導的肝損傷。

HIR 損傷主要由再灌注過程中產生的急性活性氧（ROS）誘導，急性ROS 引起氧化應激，導致肝損傷和細胞凋亡。MDA 是脂質過氧化終產物，具有細胞毒性，其水平可以用來評價細胞質膜的受損程度。SOD 存在于所有正常細胞中，對ROS 自由基具有清除作用。在HIR 誘導的肝損傷中，抗氧化標志物SOD 活性明顯降低。研究證明氧化應激可以通過壞死或凋亡殺死細胞［14］。本研究中，虎杖苷能降低HIR 大鼠MDA 的水平，增加SOD 活性，間接驗證了虎杖苷的抗氧化作用。同時，虎杖苷還能降低炎癥因子的表達，抑制細胞凋亡。

Nrf2 是一種多器官保護因子。正常生理條件下，在細胞質中Nrf2 與KEAP1 結合形成復合物，當發生氧化損傷，Nrf2 激活，導致復合物解離，Nrf2 轉運到細胞核中并與抗氧化反應原件結合，編碼多種抗氧化基因［15］。HO 酶系統在細胞應激過程中發揮關鍵作用，通過血紅素間接發揮抗氧化和抗炎作用。在本研究中，HIR 大鼠肝組織Nrf2 的表達活性增加，這是HIR 引起的氧化應激的適應性反應。在給與高劑量虎杖苷治療的HIR 大鼠中，加入Nrf2 抑制劑ML385 能明顯減弱虎杖苷對HIR大鼠肝損傷的治療作用，從側面驗證了Nrf2 對HIR 具有保護作用［16］。在HIR 誘導的大鼠中，HO-1 水平的升高伴隨著顯著的肝損傷，這意味著應激誘導的HO-1 升高不足以保護肝臟免受IR 引起的肝損傷［17］。在本研究中，虎杖苷能增加Nrf2和HO-1 蛋白表達，且加入Nrf2 抑制劑ML385 能降低Nrf2 和HO-1 蛋白表達，說明虎杖苷對HIR 損傷的保護作用可能與Nrf2／HO-1 信號通路的激活有關。

綜上所述，虎杖苷通過激活Nrf2／HO-1 信號通路，抑制肝炎癥及氧化損傷，有效緩解HIR 誘導的肝損傷。