迷迭香酸通過MAPKs 信號通路對H2O2誘導的星形膠質細胞凋亡的影響

曾曉紅，梁 波，鄭瑞芳，劉砥威?

（1.新疆烏魯木齊市第一人民醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830004；2.哈密市食品檢驗所，新疆哈密 839000；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊 830004）

腦卒中是世界上最常見的神經功能障礙疾病，也是導致死亡的第二大原因［1］。星形膠質細胞是中樞系統(tǒng)最豐富的細胞［2］，在中樞神經系統(tǒng)中起廣泛作用，參與調節(jié)神經發(fā)育、神經代謝和腦代謝，保護神經元免受氧化應激和興奮性氧化的影響，對神經細胞的存活至關重要［3］。氧化應激是導致很多病理機制的潛在因素，星形膠質細胞易受到氧化應激的影響，導致星形膠質細胞功能受損［4］。星形膠質細胞是潛在的腦卒中治療靶點，因此研究氧化應激對星形膠質細胞的損傷至關重要。

香青蘭Dracocephalum moldevica L.是新疆地產民族藥，臨床上常用于腦缺血性腦損傷的治療，具有抗氧化和腦神經保護活性，可對抗多種原因引起的腦神經細胞凋亡［5-7］。酚酸類化合物迷迭香酸是香青蘭中主要的有效成分，具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等作用［8］。在制藥、食品及化妝品領域具有較高的應用價值，因此，對迷迭香酸進行研究具有一定的研究意義［9］。首次對迷迭香酸星形腦神經膠質細胞氧化應激損傷保護作用進行研究，以期為腦卒中的治療提供參考。

1 材料

迷迭香酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111871-201001）；U87 細胞（中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號1932595）；0.25%胰酶（美國Hyclone 公司）；CCK-8 檢測試劑盒（美國博士德公司，批號13C21C60）；p-P38-MAPK（批號9215）、p-ERK1／2 抗體（批號4370）、Bax Antibidy（批號2772）、Bcl-2（批號3498）、caspase-3（批號2202）均購自美國Cell Signaling Technology 公司；GAPDH（英國Abcam 公司，批號18AFO0403）；丙二醛測定試劑盒、乳酸脫氫酶測定試劑盒（中國南京建成生物工程研究所）；所有其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) U87 細胞是人腦星形膠質母細胞瘤細胞，DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，輔加10% 胎牛血清、100 μg／mL青霉素、100 μg／mL 鏈霉素，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，當細胞融合度達到85%～90% 時，用0.25% 胰蛋白酶消化液消化細胞，以1 ∶2 的比例進行傳代，每隔2～3 d 傳代1 次，取對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)板中進行后續(xù)實驗。

2.2 氧化應激損傷模型構建 氧化應激模型模擬腦卒中星形膠質細胞損傷的病理變化，H2O2是氧化劑，可使活性氧大量激增造成氧化應激損傷。用0.5 mmol／L H2O2誘導U87 細胞40 min，模擬星形膠質細胞氧化應激損傷。

首先將細胞隨機分為高葡萄糖DMEM 治療對照組、氧化應激損傷模型組和藥物干預治療組。每一組根據(jù)迷迭香酸濃度100、50、25、5 μmol／L 進一步分為4 個亞組，每組設置3 個平行復孔U87 細胞進行不同濃度迷迭香酸預處理6 h，觀察其對氧化應激損傷的影響。

2.3 細胞活性和乳酸脫氫酶釋放檢測 測定細胞活力和細胞膜釋放的乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）通過CCK-8 試劑盒法和LDH 測定試劑盒-微量酶標法，分別按照說明書的指示，用酶標法進行檢測。

2.4 細胞內脂質過氧化物丙二醛檢測 通過細胞丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒-酶標法測定MDA 水平，按照說明書的指示，用酶標儀進行檢測。

2.5 活性氧檢測 細胞內活性氧（Route Operation System，ROS）水平檢測，利用ROS 可以將2′，7′-二乙酰二氯熒光素（DCFH-DA）氧化成為可檢測的綠色熒光物質2，7-熒光素二醋酸的原理，檢測細胞內ROS 水平。使用流式細胞儀和酶標儀進行拍照及分析，激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射波長為535 nm，以細胞內平均熒光強度（Mean_ AvgInten）表示ROS 水平。

2.6 Western Blot 檢測各組U87 細胞P-P38-MAPK、PERK1／2、Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白的表達 P-P38-MAPK／P-ERK1／2 及其下游凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3等信號通路蛋白表達檢測采用免疫印跡實驗。U87 細胞在裂解液（50 mmol／L Tris-HCl，pH 7.4、20 mmol／L EDTA、0.1% 十二烷基硫酸鈉、100 mmol／L NaCl、1% NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、50 mmol／L 氟化鈉、1 mmol／L 原釩酸鈉、1 mmol／L PMSF、2 mmol／L 焦磷酸鈉、1 μg／mL 抑肽素A、100 μg／mL 亮抑肽酶和復合蛋白酶抑制劑）中完成組織蛋白提取工作。蛋白樣品經沸水煮3 min，加入SDS-多聚丙烯酰胺凝膠。完成電泳，將蛋白電轉至PVDF 薄膜上。然后浸入1 ∶2 000 稀釋的一抗，4 °C 孵育過夜。次日用TBST 洗滌數(shù)次，再與HRP 偶聯(lián)的二抗室溫孵育45 min。最后使用ECLTM 檢測試劑盒使目的蛋白條帶發(fā)光，條帶區(qū)域和相對光密度值使用圖像密度計算軟件進行處理。實驗結果以目的蛋白平均光密度對GAPDH 平均光密度的相對值表示。

2.7 統(tǒng)計學分析 所有實驗均進行了3 次平行實驗。采用SPSS21.0 進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 迷迭香酸預給藥對U87 細胞氧化損傷的保護作用 與對照組比較，模型組細胞存活率降低（P＜0.05）。與模型組比較，迷迭香酸處理后細胞存活率升高（P＜0.05），見圖1。與對照組比較，模型組細胞LDH 的釋放升高（P＜0.05），與模型組比較，迷迭香酸處理后LDH 的釋放減少，且呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖2。與對照組比較，模型組細胞MDA 的釋放升高（P＜0.05），與模型組比較，迷迭香酸處理后MDA 的釋放減少，且呈劑量依賴性（P ＜0.05），見圖3。說明迷迭香酸具有清除氧自由基MDA，減少機體過氧化的程度，減少細胞損傷的程度。

圖1 迷迭香酸對H2O2損傷U87 存活率的影響（，n＝3）

圖2 迷迭香酸對H2O2損傷U87 LDH 釋放的影響（，n＝3）

圖3 迷迭香酸對H2O2損傷U87 MDA 釋放的影響（，n＝3）

3.2 迷迭香酸對減少線粒體活性氧的產生 圖4 顯示，與對照組比較，模型組U87 細胞DCFH-DA 的熒光強度增加（P＜0.05）；與模型組比較，迷迭香酸治療組，DCFH-DA的熒光強度降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。結果表明迷迭香酸可以減少線粒體內ROS 的產生，改善線粒體功能障礙，調節(jié)細胞環(huán)境平衡。

3.3 迷迭香酸降低MAPKs 及其下游凋亡信號的表達 圖5～6 顯示，與對照組比較，模型組上調p-P38MAPK、caspase-3、Bax 蛋白表達；p-ERK1／2、Bcl-2 蛋白的表達下調。與模型組比較，迷迭香酸顯著降低前三者蛋白的表達量；上調p-ERK1／2、Bcl-2 蛋白的表達。

圖4 迷迭香酸對H2O2損傷U87 ROS 釋放的影響（，n＝3）

圖5 MAPKs 及其下游凋亡信號的表達（，n＝3）

圖6 Bcl-2 蛋白的表達（n＝3）

4 討論

幾十年來，腦卒中研究主要集中在神經元。然而，僅針對細胞死亡的神經元機制的干預最終未能促進神經恢復或減少缺血誘導的損傷［10］。研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中后神經細胞存活需要膠質細胞，特別是星形膠質細胞的存活和功能維持［11］。一項研究表明，在腦缺血中維持和保護星形細胞功能可能比神經元更重要［12］。缺血性損傷后，星形膠質細胞發(fā)生腫脹，星形膠質細胞間隙連接可能保持不緊，導致谷氨酸的吸收和釋放平衡惡化，以及促凋亡因子的擴散，這可能加速周圍神經元的細胞死亡［13-14］。因此，神經膠質細胞（包括星形膠質細胞）在氧化應激下的存活可能對減少神經元死亡，限制梗死面積至關重要［15］。因此本實驗對迷迭香酸保護腦卒中星形膠質細胞損傷進行研究。

線粒體是細胞能量的來源，調節(jié)ATP 需求與供應，調節(jié)Ca2+信號，協(xié)調局部代謝，整合生存／死亡信號。進一步對線粒體內ROS 進行檢測顯示，星形膠質細胞ROS 釋放大量激增，誘發(fā)細胞凋亡蛋白發(fā)生變化，從而導致線粒體損傷，誘導細胞凋亡。迷迭香酸預保護后可以明顯減少ROS的產生，減少LDH、MDA 的釋放，保護線粒體免受氧化應激損傷的影響，從而抑制細胞凋亡。

p38MAPK 過度激活是造成缺血性損傷的原因，最終導致線粒體釋放凋亡蛋白Bax，啟動caspase 凋亡信號蛋白，引起細胞凋亡。ERK1／2 是抗凋亡蛋白，具有抗凋亡作用。迷迭香酸預保護后可以逆轉這些蛋白的變化，并且可以平衡Bax 和Bcl-2 凋亡和抗凋亡蛋白的表達，起到保護星形膠質細胞的作用。