腎衰泄濁湯及其拆方對UUO大鼠VEGF/VEGFR信號通路的影響

萬鳴宏 羅富里 江堅青 魏志鑫 晏子友▲

1.江西中醫藥大學，江西南昌 330000；2.江西中醫藥大學附屬醫院腎內科，江西南昌 330004

腎間質纖維化（RIF）是大部分慢性腎臟病發展到尿毒癥時均會出現的病理表現。其形成與周細胞-肌成纖維細胞轉分化（PMT）有關，腎臟損傷使血小板衍生生長因子、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路被激活，周細胞持續向肌成纖維細胞轉化，形成腎間質纖維化[1]。其中，血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）主要見于腎小球毛細血管內皮細胞中，而血管內皮生長因子受體A（VEGFA）則可刺激內皮細胞有絲分裂和細胞遷移[2]。PMT過程使細胞外基質（ECM）持續累積，最終結果導致正常腎臟結構被破壞[3]。α-平滑肌激動蛋白（α-SMA）的表達與ECM的增多呈正相關，且為周細胞的標志性分子[4]。慢性腎臟病的中醫病因可歸結于虛、濕、瘀、毒[5]，腎衰泄濁湯是以通腑泄濁化瘀為法而制成的中藥復方，可能通過抑制VEGF信號通路的激活，進而改善腎功能。因此，本研究通過觀察腎衰泄濁湯及其拆方對UUO大鼠模型中α-SMA及VEGF/VEGFR信號通路分子蛋白表達的影響，探究腎衰泄濁湯及其拆方對RIF可能的治療途徑，為中藥治療腎纖維化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物分組與造模

取144只SD雌性大鼠[SPF級，合格證號：SCSK（浙）20170001，購于浙江省醫學科學院實驗動物中心]，體重180～200g，適應喂養1周后隨機分為 6組：（1）假手術組、（2）模型組、（3）腎衰泄濁湯組、（4）補虛方組、（5）袪邪方組、（6）貝那普利組，每組24只，常規分籠飼養。UUO動物模型參考文獻[6]制作：實驗大鼠于手術前12h 禁食、不禁水，術前稱重，然后腹腔注射5.0%水合氯醛（10 ml/kg體重），待大鼠麻醉后，俯臥固定于手術臺，行左側輸尿管結扎術，假手術組只作分離。

1.2 藥物及試劑

腎衰泄濁湯組[生大黃10 g（后下）、巴戟天10 g、生黃芪30 g、丹參15 g、蒲公英15 g、槐花10 g、生牡蠣 30 g]、補虛方組（生黃芪 30 g、巴戟天 10 g）、袪邪方組 [生大黃 10 g（后下）、丹參 15 g、槐花 10 g、蒲公英15 g、生牡蠣30 g]。所有三種中藥（均來自江西中醫藥大學中藥飲片廠）常規水煎，濃縮成如下劑量：每毫升含0.8 g生藥量，每袋150 ml，真空密封包裝，存于4℃冰箱。

福州邁新生物技術開發有限公司提供HE 染色試劑盒、Masson染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒；北京中杉金橋生物技術有限公司提供磷酸緩沖液（PBS）。鹽酸貝那普利（洛丁新，北京諾華制藥有限公司，規格：10 mg/片，H2003014）。

1.3 治療方法

術后第3天，中藥治療組大鼠按10倍于臨床用藥劑量（即成人劑量10倍）折算為等效劑量給藥，即（3）（4）（5）組分別按 0.8 g/ml 腎衰泄濁湯、補虛方、袪邪方濃縮劑給藥，劑量均為8.0 g/（kg·d）灌胃；（6）組大鼠貝那普利 1.5 mg/（kg·d）灌胃，假手術組、模型組予等量生理鹽水灌胃。術后第7、14、21天給藥，2 h后腹主動脈取血并處死，將血液滴入含0.4 ml，4% EDTA-Na2抗凝管中，離心250 g×10 min并分離血清，于-20℃冰箱保存。

1.4 檢測方法

1.4.1 腎組織學檢查 腎組織標本經4%福爾馬林液、石蠟處理后制成約4 μm 厚切片，行HE及Masson染色。取一塊經2.5%戊二醛、1%鋨酸固定，Epon812、醋酸鈾-枸椽酸鉛處理后的0.5 mm3腎髓質組織，電鏡（H-600 型）觀察腎組織每個時間段變化。

1.4.2 HE及Masson染色 腎臟組織行HE染色后，根據腎臟損傷指數觀察指標（腎小管擴張、腎小管萎縮、腎小管上皮空泡變性等）。每張切片隨機選取10個互不重疊的皮質處腎小管視野（×400倍），每只大鼠選5張組織切片，按參考文獻[7]Banff分級計分（0～3分），取平均值。腎臟組織行Masson 染色，每只大鼠選取5張組織切片，每張切片隨機選10個互不重疊的皮質處腎小管間質視野（×400倍），根據文獻[1]視野中膠原染色陽性面積占整個視野面積的百分比評分（0～4分），計分完成后取平均值。

1.4.3 腎組織蛋白表達 Western blot 法測定術側腎臟組織勻漿α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白的表達。

1.5 統計學處理

所有數據采用SPSS 23.0統計學軟件包進行分析，計量資料采用（）表示，計數資料比較采用方差分析，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎組織病理變化

光鏡下，假手術組無明顯病理變化。術后第7天，觀察各組組織主要為炎癥和壞死病變；術后第21天，模型組組織較其他組纖維化、炎癥程度更嚴重，且正常腎臟結構喪失，可見部分鈣化甚至壞死。中藥治療的三組及貝納普利組表現優于模型組，可觀察到腎組織結構清晰，腎小球病變不明顯，可見不同程度炎癥細胞浸潤；其中腎衰泄濁湯組病變相對其他治療組較好。電鏡下，UUO大鼠造模后術側腎小管間質出現成纖維細胞，且細胞核固縮、線粒體嵴消失、腎小管基底膜增厚，膠原纖維排列規則；第14天見少量膠原纖維，腎小管間質膠原纖維明顯增多；第21天腎小管間質開始出現大量膠原纖維，且腎小管上皮細胞出現明顯細胞核固縮。經治療后上述表現有所改善，腎衰泄濁湯組改善較其他組明顯。

2.2 各組大鼠術側腎臟HE評分和Masson評分

假手術組大鼠第7、14、21天HE評分、Masson評分無明顯變化。模型組大鼠第7、14、21天HE評分和Masson評分較假手術組升高明顯（P＜0.05），各治療組第14、21天 HE評分和Masson評分明顯低于模型組（P＜0.05），腎衰泄濁湯組第21天 HE評分和Masson評分明顯低于其他三個治療組，祛邪組第14、21天HE評分和Masson評分明顯低于補虛方組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠HE評分和Masson評分（±s，分）

表1 各組大鼠HE評分和Masson評分（±s，分）

注：與同時段模型組及各治療組比較，△P＜0.05；與同時段各治療組比較，#P＜0.05；與同時段不同治療組比較，*P＜0.05；與同時段祛邪方組比較，※P＜0.05

組別 天數 只數 HE評分 Masson評分假手術組 7 8 0.21±0.12△ 0.34±0.11△14 8 0.23±0.11△ 0.34±0.12△21 8 0.24±0.12△ 0.32±0.16△模型組 7 8 1.69±0.56# 1.61±0.42#14 8 2.42±0.53# 2.20±0.47#21 8 2.86±0.43# 3.46±0.33#腎衰泄濁湯組 7 8 1.11±0.23* 0.74±0.22*14 8 1.52±0.33* 1.02±0.32*21 8 1.06±0.18* 1.13±0.45*祛邪方組 7 8 1.32±0.29 0.83±0.18 14 8 1.59±0.34 1.22±0.39 21 8 1.22±0.28 1.35±0.28補虛方組 7 8 1.33±0.32 0.88±0.18 14 8 1.61±0.37※ 1.25±0.49※21 8 1.31±0.14※ 1.53±0.34※貝那普利組 7 8 1.34±0.33 0.87±0.19 14 8 1.67±0.32 1.23±0.42 21 8 1.22±0.31 1.37±0.41

2.3 各組大鼠腎組織α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達量比較

假手術組大鼠可見少量α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達。建立UUO模型后各組大鼠α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達量明顯高于假手術組（P＜0.05），并隨著時間增長逐漸上升。在第14天時各治療組蛋白表達較模型組稍有升高 （P＜0.05）；在第21天時，各治療組大鼠 α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達量較模型組均有不同程度下降，補虛方、祛邪方組VEGFA蛋白表達稍有提升（P＜0.05）；第21天時，補虛方組α-SMA蛋白表達較祛邪方組稍有下降（P＜0.05），腎衰泄濁湯組與其他治療組比較，α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白的表達量下降更明顯（P＜0.05），表明腎衰泄濁湯的治療效果優于其他組。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達的比較

表2 各組大鼠UUO模型中Western blot檢測各個蛋白指標相對表達量（±s）

表2 各組大鼠UUO模型中Western blot檢測各個蛋白指標相對表達量（±s）

注： 與同時段模型組及各治療組比較，△P＜0.05；與同時段各治療組比較，#P＜0.05；與同時段不同治療組比較，*P＜0.05；與同時段祛邪方組比較，※P＜0.05

組別 天數 只數 α-SMA VEGFA VEGFR2假手術組 7 8 9.38±0.05 7.92±0.06 4.17±0.05 14 8 8.82±0.07△ 8.32±0.06△ 2.93±0.07△21 8 8.62±0.04△ 10.12±0.05△ 7.32±0.06△模型組 7 8 9.03±0.04 9.53±0.06 3.46±0.07 14 8 16.32±0.04# 8.91±0.04# 5.73±0.08#21 8 25.08±0.06# 22.02±0.07# 13.93±0.07#貝那普利組7 8 9.47±0.05 9.22±0.06 4.37±0.06 14 8 17.87±0.06 10.24±0.04 12.67±0.07 21 8 24.59±0.04 20.32±0.07 13.11±0.07腎衰泄濁湯組7 8 9.61±0.04 9.53±0.06 4.82±0.05 14 8 16.56±0.06 12.42±0.06 13.19±0.05 21 8 24.08±0.06* 18.54±0.06* 12.29±0.08*補虛方組7 8 9.83±0.06 9.80±0.06 5.55±0.04 14 8 20.77±0.06 11.79±0.06 14.07±0.06 21 8 24.63±0.05※ 22.87±0.06 13.06±0.06袪邪方組7 8 9.81±0.05 10.61±0.06 5.18±0.05 14 8 20.22±0.07 11.37±0.05 13.63±0.06 21 8 24.74±0.06 23.28±0.06 13.84±0.07

3 討論

隨著慢性腎臟病發病率的提升，RIF患者的數量也在逐漸提升[8]。故如何延緩RIF進程已成為當代研究熱點。纖維化與數個生長因子及信號通路有關，如何抑制生長因子及信號通路的表達，是延緩纖維化進程的關鍵[9-10]。纖維化時，周細胞與內皮細胞分離，內皮細胞結構破壞、微血管裂解，導致組織缺氧以及ECM的沉積[11]。VEGF參與RIF的形成過程，其主要作用是調節血管的生成、通透性，并誘導內皮細胞增殖，內皮功能受損、組織缺氧等因素均可能導致VEGF水平升高[12]。VEGF信號通路可為PMT產生的ECM及膠原纖維提供營養物質，進而加重腎纖維化[13]，同時表明，阻斷VEGF信號通路可減弱腎臟纖維化，限制周細胞的增殖和與毛細血管的分離，且VEGFR2 的阻斷對于防止周細胞分化為肌成纖維細胞有著更明顯的作用[14]。故通過研究腎衰泄濁湯及其拆方對VEGF/VEGFR通路的影響有著重要意義。

本研究經過多年臨床及實驗，認為RIF病機為本虛（脾腎）、標實（瘀、濕、毒）互相作用，最終導致RIF形成[15-16]。疾病早期，標實為主，故以通腑泄濁化瘀為法，即用大黃、牡蠣泄濁毒，丹參、槐花清瘀熱，蒲公英解毒利尿；疾病晚期，正氣耗傷，所謂“正氣存內，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”，虛為本，故扶正以補虛，以助通絡，即用生黃芪利尿消腫、補氣升陽，巴戟天補腎陽、祛濕濁。中藥具有多成分、多靶點的治療優勢，通過多種中藥配伍，標本兼顧，能更好地發揮療效，延緩RIF病情發展[17-19]。

實驗發現，第21天各治療組α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達較模型組明顯降低，腎衰泄濁湯組蛋白表達下降則優于其他治療組（P＜0.05）。說明腎衰泄濁湯組可以有效降低相關蛋白表達，達到延緩纖維化進程的作用。另外，第21天腎衰泄濁湯對VEGF信號通路的干預效果要優于貝納普利組，說明腎衰泄濁湯較貝納普利組有著多靶點治療上的優勢。補虛方組在第21天降低α-SMA蛋白表達的效果優于祛邪方組，說明補虛方對阻止ECM的形成較祛邪方更明顯；RIF后期主要以本虛為主，治療上應以補虛為重。本實驗發現，通過調整祛邪方和補虛方的比例，也許可以影響VEGF/VEGFR信號通路相關的蛋白表達，但具體影響機制仍不清楚。各治療組第21天雖能降低相關蛋白表達，但纖維指數及蛋白表達量、相對表達量仍高于假手術組，說明RIF進程的不可逆性，但腎衰泄濁湯的確能延緩RIF進程。

綜上所述，腎衰泄濁湯確實能夠抑制α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達，且效果相對優于其他治療組。其治療機制可能是通過標本兼治、補虛通腑泄濁法來抑制ECM的積累及VEGF信號通路的激活，進而降低α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白的表達，改善腎功能，延緩RIF發展。