基于超高效液相色譜-高分辨質譜和滲透壓校正樣本濃度變異性的尿液代謝組學分析

何祉安, 林厚維, 桂 娟, 朱偉超, 何建華, 汪 航, 馮 蕾*

(1.上海交通大學藥學院,上海 200240;2.上海交通大學分析測試中心,上海 200240;3.上海交通大學醫學院附屬新華醫院小兒泌尿外科,上海 200092;4.嘉興學院附屬嘉興市婦幼保健院小兒外科,浙江 嘉興 314051;5.寧波大學醫學院附屬醫院小兒外科 浙江 寧波 315020)

代謝組學(metabolomics)是通過對某一生物或細胞內所有相對分子質量較低(<1 000)的代謝物質進行定性和定量分析,進而將內外因素作用下產生的代謝物質的動態變化與生理病理相關聯的學科[1]。作為系統生物學的最下游,代謝組學反映了生物體受到各種內外環境擾動后的實際狀態和不同個體之間的表型差異[2]。超高效液相色譜-高分辨質譜技術(UPLC-HRMS)具有靈敏度高、分析通量大、覆蓋范圍廣的優勢,是代謝組學采用的主要技術之一[3]。代謝組學在生物醫學領域具有廣泛的應用,例如尋找早期診斷疾病的關鍵指征、評估手術預后的生物標志物和開發新的藥物等[4,5]。

尿液在臨床上易大量獲取,并且與血液相比,受蛋白質、脂質的干擾小且可避免人體的侵入性傷害,是臨床代謝組學長期關注的體液樣本[6,7]。尿液中的內源性代謝物濃度會因飲水、進食及其他生物因素而改變,跨度可達15倍,造成個體間非疾病因素的差異[8]。因此,針對尿液樣本的代謝組學研究需要進行一定的歸一化,以消除這一影響。

尿液代謝組學的歸一化處理通常分為數據采集前歸一化(以下簡稱“校正”)和數據采集后歸一化(下簡稱“歸一化”)兩個維度[9]。現有研究中,校正可通過一定的濃度估計參數進行固相萃取(SPE)[10]、調整進樣量[11]或稀釋[12]等前處理過程來實現。歸一化主要有肌酐值或肌酐峰面積歸一化、總離子豐度(total ion abundance)、總有用峰面積(MSTUS)歸一化及24 h尿液總量歸一化[9,13]。

正常機體每天經尿液排泄的肌酐總量是恒定的,因此肌酐是尿液代謝組學研究中最常被使用的校正或歸一化參數[14,15]。然而,肌酐的排泄仍可能受到性別、年齡、體重指數(BMI)、藥物以及腎損傷等因素的影響,進而限制了這一方法的適用范圍[12,16,17]。滲透壓(osmolality,Π)的大小可以反映代謝物總量,并且受生理、環境因素的影響小,其測定可獨立完成,冰點法測定快速方便,所需樣本量少[18,19]。目前,滲透壓常常僅作為數據采集后的歸一化參數[9,20],基于滲透壓的數據采集前校正方法十分少見,有部分報道[10]采用滲透壓校正結合固相萃取實現,前處理較為復雜,不利于重復操作,并且缺乏臨床樣本的評價和驗證。

因此,本研究以先天性腎積水患者尿液為研究對象,建立了基于滲透壓的校正方法。利用單變量和多變量統計分析,從方法的重復性、組內及組間差異、統計模型的擬合預測能力等角度對校正方法同已有研究做了比較和驗證,旨在為后續的尿液代謝組學研究提供指導和參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Vanquish UPLC超高效液相色譜系統、Q Exactive plus四極桿-靜電場軌道阱質譜儀(美國Thermo Fisher公司);OM-819.C冰點滲透壓儀(中國雅森公司);TGL-16臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗儀器有限公司);ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,美國Waters公司)。

乙腈、甲醇(質譜級)均購自美國Thermo Fisher公司;甲酸(色譜級)購自德國CNW試劑公司;肌酐(東京化成工業株式會社);實驗用水采用Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)制備。

尿液樣本來自2019年嘉興學院附屬嘉興市婦幼保健院小兒外科確診的10例先天性腎積水患者(疾病組，U)和同期性別、年齡匹配的13例健康志愿者(對照組，HC)，收集后置于-80 ℃冰箱保存。本研究經嘉興市婦幼保健院倫理委員會審定(編號：2019(倫)-69)，合理可行。

1.2 滲透壓的測定

使用純水和標準溶液對冰點滲透壓儀進行0、300及900 mOsm 3點校準,校準完成后即可開始測樣。取100 μL樣品,置于1.5 mL離心管中，固定樣品管位置,調整高度直至探針末端完全浸沒在溶液中。將樣品管推至下方冷阱,儀器自動開始檢測。待示數穩定后讀數,棄去樣品管,無塵紙擦凈探針,測試下一樣品。每連續測定10個樣本,需測定1次純水作0點參比,超過±3 mOsm需重新校準。

1.3 尿液樣本的制備與校正

尿液樣本從-80 ℃冰箱中移至室溫下解凍,渦旋1 min。每個樣本取等量混合,制備質控(QC)樣本。QC樣本隨其他樣本一起進行前處理,它反映了樣本的平均水平。在進行UPLC-HRMS分析時,先連續進樣10次QC樣本平衡儀器,每隔10個樣品插入1個QC樣本,序列最后重復進樣3次QC樣本,用于監控儀器的靈敏度和穩定性。基于滲透壓的校正,關鍵在于保證樣本進樣體積(V,μL)與滲透壓值的乘積處于同一水平。因此校正過程可通過調整V或Π兩種方式實現。

1.3.1調整進樣體積

取尿液樣本500 μL,加入等體積甲醇,渦旋1 min,混合均勻,于-20 ℃靜置2 h,低溫離心(4 ℃,12 000 r/min)20 min,取上清液置于進樣瓶中待測。假定所有樣本中滲透壓的最低值為ΠLowest,其余樣本的滲透壓值為ΠSample,則稀釋倍數FVolume=ΠSample/ΠLowest。在進行儀器分析時,假定滲透壓最低的樣本進樣量為n(μL),則其他樣本的V為n/FVolume(μL)。

1.3.2稀釋樣本

根據實際樣本的滲透壓大小,確定稀釋后適宜的樣本滲透壓ΠReference,則稀釋倍數FDilution=ΠSample/ΠReference。取樣本mμL,加入超純水(FDilution-1)×mμL、甲醇m×FDilutionμL,渦旋1 min,混合均勻,于-20 ℃靜置2 h。靜置完成后,低溫離心(4 ℃,12 000 r/min)20 min,取上清置于進樣瓶中待測。在進行儀器分析時,等體積進樣。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫:40 ℃;流動相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速:0.4 mL/min,樣品室溫度:8 ℃。線性梯度洗脫程序:0～1.0 min,1%B;1.0～7.5 min,1%B～20%B;7.5～9.5 min,20%B～30%B;9.5～13.5 min,30%B～35%B;13.5～15.5 min,35%B～70%B;15.5～16.0 min,70%B～100%B;16.0～18.0 min,100%B;18.0～18.1 min,100%B～1%B;18.1～20.0 min,1%B。等體積進樣實驗,進樣量設為5 μL;校正進樣體積實驗,進樣量按照1.3.1節計算調整。

1.4.2質譜條件

離子源為加熱電噴霧電離(HESI)源;噴霧電壓為3.2 kV;毛細管溫度為320 ℃;鞘氣流速為55 arb;輔助氣流速15 arb;不設反吹氣;加熱溫度350 ℃。在正離子掃描模式下獲得代謝物指紋圖譜;質譜采集模式為輪廓(profile)模式;全掃描范圍為m/z60～900;全掃分辨率為70 000;自動增益控制(AGC)設為1×106個離子;離子注入時間為100 ms。MS/MS在Top5模式下進行數據依賴型采集( DDA);分辨率為17 500;最大進樣時間為50 ms;隔離窗口m/z1.5;碰撞能為(30±15)eV。樣品在分析時隨機進樣,以避免儀器波動造成的影響。

1.5 數據處理

1.5.1數據預處理

將原始數據(.raw格式)導入Progenesis QI軟件中進行峰提取、峰對齊、去卷積等數據預處理。導入數據時,過濾閾值設定為1.0,參比選擇QC樣本,峰提取的加合形式選擇M+H、M+2H、M+Na和M+NH4。對導出的數據矩陣進行過濾,最終保留的提取峰應同時滿足:1)“80%規則”,在一類組別中80%的樣本響應不為0;2)QC樣本中峰面積變異系數(CV)<30%。

1.5.2歸一化

不同的歸一化法通過在Progenesis QI軟件的“Normalization method”項下選擇不同的參數實現。具體設置如下,1)肌酐峰面積歸一化:外標確證肌酐m/z為114.066 7(±5 ppm(10-6)),保留時間(0.71±0.05) min。以每個樣本中肌酐的提取峰面積做歸一化;2)總離子豐度歸一化:選擇“Total ion abundance”，以樣本中所有離子豐度的總和進行歸一化;3)MSTUS歸一化:選擇所有樣品中共有的離子，以其峰面積總和進行歸一化。

1.5.3多變量統計分析

經預處理后的數據矩陣導入SIMCA-P 14.0,經Par標準化處理后,進行主成分分析(PCA)和有監督的正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。對OPLS-DA模型做200次置換檢驗,考察是否存在過擬合。

2 結果與討論

2.1 校正方法的評價

將3個健康志愿者的尿液樣本分別梯度稀釋2、4、8和12倍,以模擬實際情況下尿液的濃度變化。所有樣本測定滲透壓,并進行前處理,分別直接等體積進樣和校正體積進樣后，進行UPLC-HRMS分析。校正進樣體積的具體信息見表1,經過校正后,所有樣本的滲透壓與進樣體積的乘積處于同一水平。

表1 樣本的滲透壓及進樣體積Table 1 Osmolalities (Π) and injection volumes (V) of samples

2.1.1樣本及其稀釋溶液的主成分分析

校正前后所得的數據集經不同歸一化處理后,進行主成分分析,所得PCA得分圖見圖1,相同顏色和形狀的點表示來源于同一樣本。未經校正時,樣本點散落并與稀釋倍數呈現一定的規律,僅通過歸一化無法改善同源樣本的聚集情況。經過校正后,樣本及其稀釋溶液間的濃度差異被有效消除,呈現了良好的組內聚集和組間分群效應。肌酐峰面積作為尿液代謝組學常用的歸一化參數,在校正前后均未得到理想結果,有研究表明,這可能與肌酐的排泄易受其他生理病理因素影響有關[15]。

2.1.2校正及歸一化對重復性的影響

原始的數據矩陣經預處理共得到7 930個有效提取峰。經不同歸一化處理后,分別統計3個樣本及其稀釋溶液中峰面積RSD值<30%的峰數量,結果見圖2。根據配對t檢驗結果,確定方法間是否存在顯著性差異。峰面積RSD值<30%的峰數量在校正以后顯著增加,經總離子豐度歸一化或MSTUS歸一化可進一步提高。因此,滲透壓校正結合總離子豐度歸一化或MSTUS歸一化可有效改善方法的重復性。

2.1.3同源樣本的相關性分析

利用斯皮爾曼秩和相關系數(Spearman coefficient)評價樣本間代謝譜的相似程度,系數越接近于1,說明樣本間的相似程度越高[21,22]。稀釋溶液與其原樣本的Spearman相關系數隨稀釋倍數的變化如圖3所示,所有相關性經檢驗后p值均小于0.05。與不經校正比較,經校正后的相關系數受稀釋倍數影響更小,始終具有更好的相關性,并維持在較高水平(>0.8)。說明該校正方法可一定程度上減少尿液本身濃度帶來的組內差異,使得樣本更接近于原樣本的真實狀態。

2.2 校正方法的代謝組學驗證

以上實驗利用尿液樣本及其梯度稀釋溶液對方法進行了初步評價。然而,對于稀釋的樣本進行校正過程,近似于對同一樣本重復進樣。本研究以10例先天性腎積水患者作為疾病組,10位健康志愿者作為對照組,做進一步的方法學驗證。尿液樣本分別經等體積進樣和稀釋至同一滲透壓水平后等體積進樣兩次,然后進行UPLC-HRMS分析。

2.2.1兩種濃度估計參數的比較

肌酐值和滲透壓值都可被用于估計尿液代謝物的濃度[12]。對照組與疾病組樣本的肌酐峰面積和滲透壓分布如圖4所示,兩組的滲透壓沒有顯著性差別,但疾病組的肌酐峰面積顯著低于對照組。有研究表明,腎功能的變化會影響尿肌酐的濃度,在某些情況下,利用肌酐來歸一化尿液代謝組學數據,結果并不可靠[15]。

圖 1 校正前、后尿液樣本及其稀釋溶液的PCA得分圖(PC個數=4)Fig.1 Principal component analysis (PCA) score plots of urine and their sequentially diluted solution before and after calibration (number of principal components=4)A,B,C refer to three sample sources,the following numbers indicate different dilution multiples.

圖 2 峰面積RSD<30%的提取峰數量(n=3)Fig.2 Numbers of peaks with peak area RSD<30% (n=3)MSTUS:mass total useful signal;* p<0.05.

圖 3 樣品及其梯度稀釋溶液的Spearman相關系數Fig.3 Spearman coefficients of samples and their sequentially diluted solutions* Two regression curves were significantly different (p<0.01).

圖 4 樣本滲透壓值和肌酐峰面積的箱型圖(n=10)Fig.4 Box charts of osmolality and creatinine peak area (n=10)

此外,進行校正過程的關鍵是濃度估計參數與質譜信號間始終良好的線性相關。利用皮爾遜相關系數評價兩組數據間的線性關系,相關系數越接近1,兩組數據間的線性相關性越強[23,24]。肌酐峰面積與總峰面積僅在健康志愿者樣本中線性相關,在患者和整體中無顯著相關性(p>0.05)。說明當患者腎臟發生病變影響到肌酐的排泄時,繼續使用肌酐作為濃度估計參數可能會產生較大偏差。而滲透壓與總峰面積間的相關系數始終大于0.8(p<0.01),呈現了良好的線性。還有研究提到,社會人口學和醫學條件對尿滲透壓的影響小于對尿肌酐的影響[25]。因此,使用滲透壓估計尿液代謝物的總濃度,結果更為準確,且不易受到疾病和外界條件的干擾。

2.2.2主成分分析

用PCA比較兩次代謝組學實驗的結果。紅色圓圈表示QC樣本(Q),聚集在原點附近,表明方法的重復性良好。綠色三角代表HC,藍色方塊代表U,顏色越深表明其對應樣本的滲透壓越高。如圖5所示，未經校正時,樣本呈現了與滲透壓大小相關的分布,經校正后,樣本點的分布趨勢與滲透壓無明顯相關,并有更明顯的組內聚集和組間分群效應。

圖 5 健康志愿者和先天性腎積水患者尿液樣本的PCA得分圖(PC個數=5)Fig.5 PCA score plots of urine samples from healthy volunteers and patients with congenital hydronephrosis (Number of principal components=5)Q:quality control;HC:healthy control;U:children with congenital hydronephrosis.

2.2.3OPLS-DA

OPLS-DA可以去除與分類變量無關的組內差異,使得分類信息主要集中在一個主成分(Y)中,在代謝組學中常被用于篩選組別間的差異代謝物,因此模型的可靠性十分重要[26,27]。

統計模型的R2Y表示模型所能解釋Y變量信息的百分比,Q2通過交叉驗證得出,分別用以評價模型的擬合和預測能力。經過校正以后,健康對照組和疾病組之間在OPLS-DA模型上有了更加明顯的區分,并且R2Y和Q2值更加接近于1,表明其擬合和預測能力得到了提升(見圖6)。利用置換檢驗可得到一系列OPLS-DA模型變量解釋率R2的計算值，從而擬合出一條直線。直線在Y軸的截距越大，模型存在過擬合的可能性越高[28]。增加主成分的個數,對模型進行200次置換檢驗。經校正處理后的OPLS-DA模型,R2截距始終更小,更不易出現過擬合的情況。

圖 6 健康志愿者和腎積水患者尿液樣本的OPLS-DA得分圖(PC個數=2)Fig.6 Orthogonal partial least squares discrimination analysis (OPLS-DA) score plots of urine samples from healthy volunteers and patients with congenital hydronephrosis (Number of principal components=2)

3 結論

本研究提出了一種在UPLC-HRMS數據采集前基于滲透壓校正,結合總離子豐度或MSTUS歸一化的策略,可克服尿液樣本本身的濃度變異性。經過臨床樣本的驗證表明,該方法有效提高了代謝組學方法的重復性,消除了因尿液本身代謝物濃度變化引起的組內差異,在PCA上擁有更明顯的組內聚集和組間分群效應,并且提高了OPLS-DA模型的可靠度,更不易出現過擬合。此外,以滲透壓為基準的校正方法,受疾病因素的影響小,比肌酐校正法的適用范圍更廣,結果更加可靠。本研究可對后續各類來源的尿液代謝組學研究提供歸一化的參考和指導。

致謝 感謝上海交通大學藥學院蘇靖老師在滲透壓測定工作中的幫助和指導。