固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物源性食品中11種禁限獸藥及代謝物

劉柏林, 謝繼安, 趙紫微, 王秀莉, 單曉梅

(安徽省疾病預防控制中心,安徽 合肥,230601)

氯霉素類、硝基咪唑類、林可酰胺類與大環內酯類為常見的抗生素藥物,廣泛用于養殖過程中多種疾病的預防和細菌性感染類的治療。超量或超種類使用這些藥物后,會殘留于動物性食品中,并通過食物鏈在人體內蓄積,危害人類健康[1],我國農業部第250號公告規定食品動物中禁止使用氯霉素、洛硝達唑等藥物,國家標準GB 31650-2019規定了食品動物中甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺、林可霉素、紅霉素等藥物的最高殘留限量(MRLs)。但食品中檢出林可霉素、氯霉素、甲硝唑、紅霉素及代謝物等藥物殘留事件有報道[1-4]。獸藥殘留是目前食品安全所面臨的重大問題之一。

針對食品中多種獸藥殘留的檢測,目前報道的方法有液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(LC-QTOF/MS)[5,6]和液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法(LC-HRMS)[7-9]等,這些方法能夠提供待測物母離子和碎片離子的精確質量數,降低了近似質量數的干擾,更好地避免了假陽性的發生,是食品中多種獸藥殘留快速定性篩查的首選方法。不足的是,這些快速定性篩查方法的定量效果欠佳[10],且儀器設備昂貴。超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)因分析效率高、靈敏度高等優勢,成為抗生素殘留分析的主流檢測方法[11]。盡管采用UPLC-MS/MS測定禽蛋、水產品、蜂蜜、牛奶及奶粉等食品中多種獸藥殘留有較多文獻報道[4,12-19],但樣品前處理方法各不相同,以QuEChERS法、OasisPRiME HLB固相萃取柱凈化等方法居多,這兩種前處理方法具有簡單、快速的優勢,能解決同一樣品中多種獸藥凈化處理。但吸附劑在吸附極性與非極性雜質的同時也會吸附待測物,導致部分待測物回收率低,影響定量的準確性。而且現已報道的檢測方法中,多是檢測藥物原型,涉及代謝物的檢測方法不多。而文獻[3]報道紅霉素在酸性條件下不穩定,易降解成紅霉素A烯醇醚和脫水紅霉素A,這些降解產物被認為是使人體產生胃腸道反應的主要原因[20],所以同時檢測紅霉素及其代謝物具有重要意義。另外,國家食品安全風險監測常規項目包含林可霉素、紅霉素、甲硝唑、氯霉素類及代謝物等獸藥殘留,按現行標準方法及國家食品安全風險監測工作手冊方法[21],分為4次樣品前處理及上機測定,耗費大量時間、人力、物力與財力。因此,迫切需要建立動物源性食品中這4類獸藥殘留及代謝物的同時檢測方法。

針對上述存在的問題,本文以雞蛋、液態奶、雞肉及淡水魚樣品為基質,優化提取凈化條件,考察基質效應的影響,結合同位素內標稀釋法,有效降低了基質效應,建立了SPE-UPLC-MS/MS同時定量測定氯霉素類、硝基咪唑類、林可霉素、紅霉素共4類8種禁限獸藥與3種代謝物的殘留,實現了雞蛋、液態奶、雞肉及淡水魚中多類獸藥殘留及代謝物的同時測定,解決了常規監測采用4種前處理及儀器分析方法的難題,為食品安全風險監測及隱患排查提供高效、便捷、準確可靠的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTMUPLC超高壓液相色譜儀、ZEVO TQ MS質譜儀、AcquityTMUPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美國Waters公司);VORTEX Multi Reax高速旋渦混勻器(德國Heidolph公司);Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司);Legend Mach 1.6R高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司)。

氯霉素、甲砜霉素,純度均大于97%,購自美國Sigma-Aldrich公司;甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、林可霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺、氯霉素-D5、氟苯尼考-D3、甲砜霉素-D3、林可霉素-D3、地美硝唑-D3、洛硝達唑-D3純度均大于95%,購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;脫氧紅霉素A、紅霉素A烯醇醚、紅霉素A、紅霉素A-D6、甲硝唑-D4、氟苯尼考胺-D3純度均大于95%,購自加拿大TRC公司;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯(色譜純,德國Merck公司);乙酸銨(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司);無水磷酸氫二鈉(分析純,國藥集團化學試劑北京有限公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18填料(均為50 μm,美國Agilent公司);Oasis HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL,美國Waters公司)。

1.2 溶液的配制

分別稱取11種標準品及同位素內標適量,用甲醇溶解,并定容至刻度,配制成100 μg/mL的標準儲備液與內標儲備液,避光保存于-20 ℃冰箱。

用適量10%甲醇水溶液稀釋上述標準儲備液,混勻,分別配制成100 ng/mL的混合標準中間液與混合同位素內標溶液,現用現配。

準確移取上述混合標準中間溶液10、50、100、200、500、1 000與5 000 μL,移至10 mL容量瓶中,加入500 μL混合同位素內標溶液,用10%甲醇水溶液定容至刻度,配制成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0與50.0 μg/L的系列混合標準溶液,現用現配。

1.3 樣品前處理

樣品采集于本省不同地區的超市與農貿市場,雞肉與魚類樣品取肌肉部位,經高速組織搗碎機均勻絞碎,用四分法縮分出適量,雞蛋樣品去殼混合均勻。所有樣品均分成2份,一份用于檢測,另一份用于復檢,加封作標記,于-20 ℃保存。

稱取2.00 g(精確至0.01 g)試樣,置于50 mL聚丙烯具塞離心管中,加入50 μL混合同位素內標溶液(100 ng/mL)后,靜置30 min,先加入5 mL pH 9.0磷酸鹽緩沖溶液,渦旋振蕩5 min后,再加入5 mL乙腈,混勻后,以10 000 r/min冷凍離心10 min,取上清液于另一個離心管中,加入10 mL乙酸乙酯,渦旋30 s,靜置分層后,以10 000 r/min冷凍離心10 min,取上層液體于15 mL聚丙烯離心管中,于40 ℃以下水浴中氮氣吹至近干,殘留物用0.3 mL甲醇溶解后,加入5.7 mL磷酸鹽緩沖液,混勻,待凈化。

Oasis HLB固相萃取預先依次用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL pH 9.0的磷酸鹽緩沖溶液淋洗活化,將上述待凈化液轉移至活化后的Oasis HLB固相萃取柱上,棄去流出液,加入5 mL純水淋洗后抽干,隨后用6 mL甲醇分2次洗脫,控制流速1～2 mL/min。洗脫液于40 ℃以下水浴氮氣吹干,用1.0 mL 10%甲醇水(先加入100 μL甲醇溶解殘渣,再加入900 μL超純水)溶液定容,混勻,以10 000 r/min冷凍離心5 min,取上清液,上機測定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:10 ℃;流速:0.4 mL/min;流動相A:0.1%甲酸水溶液;流動相B:甲醇。梯度洗脫程序:0～3.0 min,90%A～60%A;3.0～3.5 min,60%A～15%A;3.5～4.0 min,15%A～10%A;4.0～4.5 min,10%A～90%A;4.5～6.0 min,90%A。進樣量:10 μL。

1.4.2質譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源;毛細管電壓:2.50 kV(負離子)和4.0 kV(正離子);離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:1 000 L/h;碰撞氣流量:0.13 mL/min;多反應監測(MRM)模式。待測物的母離子、子離子及對應的碰撞能量、錐孔電壓等質譜參數見表1。

表1 11種待測物及9種同位素內標的質譜參數Table 1 MS parameters for the 11 analytes and 9 isotope internal standards

2 結果與討論

2.1 定容溶劑的選擇

用10%～50%(v/v)乙腈水溶液、10%～50%(v/v)甲醇水溶液稀釋標準溶液,考察溶劑對待測物響應值與色譜峰形的影響。結果表明,隨著甲醇或乙腈體積分數的增加,氟苯尼考胺響應和峰形逐漸變差,出現峰伸舌與拖尾現象,當體積分數超過40%時,所有待測物均有響應不穩定且峰形展寬的現象。考慮當甲醇或乙腈體積分數為10%時,各待測物的響應高,色譜峰形尖銳、對稱。以10%甲醇為溶劑時,紅霉素A烯醇醚與脫氧紅霉素A達到基線分離,且11種待測物的響應值及峰形也較用10%乙腈水溶液時好。因此最終選擇10%(v/v)甲醇水溶液作為標準及樣品的定容溶劑。

2.2 色譜條件的優化

實驗對流動相進行了優化。分別選擇甲醇與乙腈為有機相,同時在水相中分別加入甲酸、氨水和乙酸銨,考察待測物的分離效果、色譜峰形、峰高及響應情況。結果發現,以純水或純水中加入乙酸銨為水相時,有機相無論是乙腈還是甲醇,林可霉素的峰形均較差,響應較低,需要在水相中加入酸、堿調節pH值來改善峰形。以乙腈作為有機相、水相中加入氨水時,紅霉素A、紅霉素A烯醇醚與脫氧紅霉素A的峰形較差,有伸舌與拖尾現象,且響應低,同時發現,氨水-乙腈作為流動相雖能夠增加負離子模式掃描模式下氯霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考等物質的信號強度,但是也容易使氟苯尼考的內標產生同位素峰效應,使內標的平均回收率增強4.5倍,當采用內標法定量時,往往會造成高濃度的實際樣品結果偏低。而以甲醇作為有機相,并在水相中加入氨水時,除脫水紅霉素峰形較用乙腈時有所改善外,紅霉素A與紅霉素A烯醇醚的峰形依然存在伸舌與拖尾現象,且林可霉素、氯霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考與甲硝唑等藥物的峰形較用乙腈時差,影響準確定量。雖有文獻[4]報道,堿性流動相條件下甲硝唑和林可霉素的響應值分別是酸性流動相條件下的7.5和5.4倍,但考慮同時分析紅霉素A及其代謝物,水相中加入氨水不適合。因此,選擇水相中加入甲酸,對于在負離子模式下掃描的氯霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考等物質來說,甲酸提供的H+抑制了這些化合物的解離,影響離子化效率,但能夠促進[M+H]+峰形成的同時抑制目標化合物[M+Na]+峰的形成[18],對于正離子模式來說,能夠提高離子化效率,提高靈敏度,故選擇0.1%甲酸水溶液作為水相。以甲醇為有機相時,各待測物的峰形均較乙腈時好,響應也更高,且紅霉素A烯醇醚與脫氧紅霉素A完全能夠達到基線分離。因此最終確定0.1%甲酸水溶液與甲醇作為流動相。優化后的11種禁限獸藥物及代謝物的MRM色譜圖見圖1。

圖 1 11種禁限獸藥及代謝物的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current (TIC)chromatograms of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites 1.florfenicol amine;2.metronidazole;3.ronidazole;4.dimetridazole;5.thiamphenicol;6.lincomycin;7.florfenicol;8.chloramphenicol;9.erythromycin A;10.erythromycin A enol ether;11.anhydro erythromycin A.

圖 2 磷酸鹽緩沖液的pH值對11種禁限獸藥及代謝物提取效率的影響Fig.2 Effect of different phosphate buffer pH values on the extraction efficiencies of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites

2.3 前處理條件的優化

2.3.1提取液及pH值的優化

以陰性的雞蛋樣品為實驗對象,加入11種禁限獸藥及代謝物標準溶液,使其在樣品中含量為10.0 ng,經4%氯化鈉水溶液分散、加入乙腈沉淀蛋白質后,用乙酸乙酯提取,實驗發現,紅霉素A及代謝物和林可霉素的提取效率低,加標回收率小于4%,待測物的化學性質不同,不同的提取液影響了提取效果。

據文獻[3]報道,紅霉素A在酸性條件下不穩定,在中性及弱堿性條件下穩定,故選擇pH 7.0的磷酸鹽緩沖液作為最佳提取液提取蜂蜜中紅霉素A及代謝物。張曉藝等[4]發現在pH 10.0的碳酸鹽緩沖液作為提取液的條件下,采用乙酸乙酯同時萃取蜂蜜中的氯霉素、甲硝唑和林可霉素，萃取效果較好。陳興連等[17]研究認為堿性溶液作為提取液時,不僅能很好的分散樣品,增加與有機溶劑接觸面積,充分提取藥物,同時堿溶液還能促進藥物與結合蛋白質解離,有利于提高提取效率。綜合上述學者的報道,本文選擇pH 6.0～11.0的磷酸鹽緩沖液作為萃取條件,考察不同pH值下,乙酸乙酯對11種待測物提取的效率,結果見圖2。結果表明,提取液的pH值對林可霉素提取效率的影響較明顯,隨著提取液pH值的增加,林可霉素的回收率逐漸增加,pH為9.0時回收率最高,當pH大于9.0時,林可霉素與地美硝唑的回收率降低。氯霉素類及代謝物、甲硝唑與洛硝達唑的提取效率受pH值影響不大,平均回收率為64.4%,紅霉素及代謝物在pH為8.0～11.0的響應值最高,且比較穩定。綜合考慮,本實驗選擇0.1 mol/L pH 9.0的磷酸氫二鈉溶液作為提取液。

圖 3 不同凈化方式對11種禁限獸藥及代謝物回收率的影響(n=3)Fig.3 Effect of different purification methods on the recoveries of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites (n=3)

2.3.2凈化方法的選擇

多獸藥殘留的同時測定,樣品前處理多采用QuEChERS法或吸附-洗脫模式的固相萃取法。QuEChERS法是通過吸附劑與樣品中的雜質相互作用,以實現分析物的提取和凈化,Oasis PRiME HLB固相萃取柱是一款無須活化的固相萃取柱,通過柱中的填料吸附劑樣品中的雜質,以實現分析物的提取和凈化,Oasis HLB柱、MCS柱與BRP柱為活化-洗脫型的固相萃取柱,MCS為混合型陽離子交換柱,BRP是含單分散的親水疏水表面平衡反相吸附劑的萃取柱,填料是經過表面修飾改性的聚合物,引入了極性官能基團,可以用于分離極性和非極性物質。而不同凈化方法的凈化效果取決于待測物的性質與樣品基質復雜程度。因此,本實驗對比分析了不同凈化方法的凈化效果。結果如圖3所示,采用Oasis PRiME HLB柱凈化,氟苯尼考胺的回收率為21.4%,甲砜霉素、林可霉素及氯霉素的回收率均大于120%;采用QuEChERS法處理樣品時,待測物的平均回收率為58.1%～129%,林可霉素、紅霉素A烯醇醚的回收率大于120%,而脫氧紅霉素A的回收率為58.1%;采用MCS柱凈化,3種氯霉素類的平均回收率為82.3%～93.3%,但甲硝唑、林可霉素、地美硝唑與氟苯尼考胺的回收率比較低,分別為57.5%、52.3%、43.1%與27.1%,用BRP柱凈化時,林可霉素與地美硝唑的回收率較低,分別為39.7%與37.0%。而采用Oasis HLB柱凈化時,各待測物的平均回收率為69.9%～97.2%。綜合考慮,本實驗選擇Oasis HLB柱為最佳凈化固相萃取柱。

2.4 基質效應考察

基質效應(ME)是指基質中的共提取干擾物影響目標化合物的離子化[6],從而影響目標物響應的現象。基質效應越強,方法的準確性越低[18]。本實驗選擇雞蛋、雞肉、液態奶與淡水魚陰性樣品為基質,采用1.3節描述的方法處理樣品,獲得空白基質提取液，分別制備基質匹配標準曲線與溶液標準曲線。根據文獻[22,23]報道,采用ME=[基質匹配標準曲線的斜率/溶液標準曲線的斜率-1]×100%來計算11種禁限獸藥及代謝物的基質效應,以評價不同基質中共提取干擾物對目標物響應的影響。

如圖4所示,紅霉素烯醇酯在4種樣品中均存在中等基質效應,|ME|為20%～50%,脫氧紅霉素A在淡水魚、雞蛋與液態奶樣品中存在中等基質效應,甲砜霉素在液態奶樣品中為中等基質效應,其他待測物屬于弱基質效應,|ME|為0～20%。因此,本實驗采用基質匹配的同位素內標法加以校正。

圖 4 不同基質樣品中11種禁限獸藥及代謝物的基質效應Fig.4 Matrix effects of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolitesindifferent samples

2.5 方法學驗證

2.5.1標準曲線與線性范圍

以陰性淡水魚為基質樣品,按照1.3節描述提取和凈化,氮氣吹干后復溶獲得基質溶液,用該基質溶液配制成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/L的系列混合標準溶液,加入同位素內標溶液,使其質量濃度為5.0 μg/L,上機分析,內標法定量。以待測物與相對應同位素內標的峰面積之比為縱坐標(y),相應的質量濃度為橫坐標(x,μg/L),繪制基質匹配標準曲線。結果表明,11種待測物在各自范圍內線性關系良好,相關系數(R2)>0.99(見表2)。

2.5.2檢出限及定量限

根據國家標準GB/T 27417-2017《化學分析方法確認和驗證指南》的相關要求,分別添加不同低濃度的11種混合標準溶液到陰性樣品中,對11種待測物進行測定,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)對應的加標濃度定義檢出限(LOD)與定量限(LOQ)。結果表明,該方法的LOD為0.050～0.50 μg/kg,LOQ為0.20～1.5 μg/kg(見表2)。

表2 11種禁限獸藥及代謝物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (R2),LODs,and LOQs for the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites

2.5.3加標回收率及精密度

根據GB/T 27404-2008要求,對于食品中的禁用物質,分別添加約1、2、和10倍方法定量限水平的標準溶液于實際樣品中,進行加標回收試驗;已制定MRL的,應該在方法定量限、MRL選一合適點,未制定MRL的,在方法定量限、常見限量指標選一合適點進行加標回收試驗。國家限量標準GB 31650-2019中規定,雞肉、雞蛋、牛奶與魚肉中紅霉素A的MRL值分別為100、50、40與200 μg/kg;雞肉、雞蛋、牛奶與魚肉中林可霉素的MRL分別為200、50、150與100 μg/kg;雞肉、牛奶與魚肉中甲砜霉素的MRL均為50 μg/kg;雞肉、魚肉中氟苯尼考與氟苯尼考胺之和的MRL分別為100 μg/kg和1 000 μg/kg;我國農業部第250號公告規定食品動物中禁止使用氯霉素與洛硝達唑。根據上述加標規則,本實驗選用空白本底的雞蛋、魚肉、雞肉和液態奶為樣品,添加11種待測物標準溶液,加標水平如表3所示,加入同位素內標混合液,上機測定,每個添加水平重復6次。結果表明,11種待測物的平均加標回收率為65.3%～108%,相對標準偏差為0.40%～21%。

表3 11種禁限獸藥及代謝物在實際樣品中的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites in real samples (n=6)

2.6 實際樣品的測定

采用該方法對市場上隨機購買的80份雞蛋、80份雞肉、40份液態奶與32份淡水魚進行檢測,同時分別采用國標方法GB 29684-2013測定紅霉素,GB/T 20762-2006測定林可霉素,GB/T 20744-2006測定硝基咪唑類,GB/T 20756-2006測定氯霉素類與SN/T 1865-2016測定氟苯尼考胺,考察本方法的可靠性。

結果表明,其中1份雞蛋樣品同時檢出甲硝唑、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺,檢出值分別為12.1/12.5 μg/kg(前者為本方法測定值/后者為標準方法測定值,下同)、7.52/7.06 μg/kg與12.3/12.4 μg/kg;1份雞蛋中檢出氟苯尼考,檢出值為3.23/3.03 μg/kg;1份雞蛋與1份雞肉中分別檢出甲硝唑,檢出值為0.125/0.100 μg/kg與0.144/0.129 μg/kg。將該分析方法與標準方法所獲取的陽性樣本數據進行統計學分析,結果顯示,兩套分析方法無顯著性差異(t=0.283,P=0.788)。可見本方法準確可靠。

3 結論

本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜同時測定動物源性食品中11種禁限獸藥及代謝物的方法,結合同位素稀釋技術,有效降低了實際樣品的基質效應。該方法穩定性好,準確度高,適用于食品中多種痕量獸藥殘留及代謝物的同時檢測。與現行國家標準方法相比,本方法能夠實現不同類別的獸藥殘留及代謝物同時前處理與分析,縮短了檢測周期,節約了檢測成本,為例行監測提供支持。