LAMP在臨床上診斷肺結(jié)核的應(yīng)用評(píng)價(jià)

廖潔，陳小林，李小玲

（1.萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 萍鄉(xiāng) 337000；2.萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江西 萍鄉(xiāng) 337000）

結(jié)核病是在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群影響下所引發(fā)的慢性傳染病，具有較高的死亡率，近年來(lái)我國(guó)結(jié)核病發(fā)病率逐年上升，因此，對(duì)結(jié)核病的防控尤為重要[1]。目前，結(jié)核病病原學(xué)檢測(cè)主要采用痰涂片培養(yǎng)法及抗酸染色法兩種，但傳統(tǒng)方法在結(jié)核病變?cè)瓕W(xué)檢測(cè)中已無(wú)法滿足臨床早期診斷，因此，尋求快速有效的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)技術(shù)在提高疾病診療水平中具有重要意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是基于恒溫?cái)U(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)，在聚合酶等條件下對(duì)標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物與核算染料結(jié)合后，可發(fā)出檢測(cè)信號(hào)，進(jìn)而判斷標(biāo)本中是否存在病原體[2]。基于此，本研究旨在探究采用LAMP在肺結(jié)核中的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年5月至2020年3月在本院進(jìn)行檢查的50 例肺結(jié)核和50 例正常對(duì)照作為研究對(duì)象，其中男57例，女44例；年齡19～76歲，平均年齡（47.60±3.90）歲。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核患者經(jīng)胸部CT及X線診斷可見肺部存在活動(dòng)性肺結(jié)核病變，且經(jīng)支氣管肺泡灌洗液檢查可見支氣管及肺部組織均含有抗酸桿菌；臨床資料完整；自愿參與，均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往存在結(jié)核病史；合并凝血功能障礙；參與本研究前7 d使用抗凝藥物治療；伴有嚴(yán)重的肝、腎、心功能異常；病情危重，無(wú)法完成研究者。

1.3 方法 所有患者均行LAMP 檢測(cè)、L-J 培養(yǎng)及痰涂片檢查。①LAMP 檢測(cè)：首先，采集所有患者痰液樣本，并于痰液樣本內(nèi)加入4%氫氧化鈉溶液，充分震蕩混勻后于常溫條件下靜置15 min。隨后使用吸管吸取1 mL 痰液樣本，并滴入離心管內(nèi)，10 000 r/min 離心處理痰液樣本10 min，留取試管底部沉淀物，并向內(nèi)加入濃度為0.9%氯化鈉溶液1 mL 洗滌沉淀物。向洗滌后的沉淀物中加入100 mL 核酸提取物，

混合均勻后將其放置于95 ℃沸水中行水浴處理10 min。隨后將其取出并快速冷卻至室溫后行離心處理。取離心處理后的上層清液2 mL 置于反應(yīng)試管中，并依次向試管內(nèi)加入20 mL 密封液及1 mL 聚合酶，對(duì)該樣本行離心處理5 s 后放置于恒溫?cái)U(kuò)增儀中行擴(kuò)增處理，設(shè)置溫度為63 ℃，處理時(shí)間為40 min，將處理后的樣本使用恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。②L-J培養(yǎng)：取4倍體積的4%氫氧化鈉溶液溶于痰液標(biāo)本中，充分震蕩并搖勻，將其靜置于室溫條件下15 min，使痰液完全液化。使用無(wú)菌吸管吸取2～3 滴痰液標(biāo)本，均勻分布于酸性培養(yǎng)基斜面上，并放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，記錄相關(guān)結(jié)果。③痰涂片檢查：行痰涂片檢查時(shí)需將標(biāo)本完全干燥，玻片經(jīng)火焰固定后加入苯酚復(fù)紅染液后將玻片蓋滿，染色5 min 后用流水沖洗，隨后瀝干玻片上水分后滴加脫色液保持1 min，另加亞甲藍(lán)溶液后染色30 s，干燥后行鏡檢檢查。

1.4 觀察指標(biāo) 以痰涂片檢查作為診斷肺結(jié)核金標(biāo)準(zhǔn)，分析LAMP、痰培養(yǎng)在肺結(jié)核中的診斷價(jià)值，包括靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度等。LAMP陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：痰液樣本的擴(kuò)增曲線呈S型，其數(shù)值高于樣本中含有的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。LAMP陰性判定標(biāo)準(zhǔn)：痰液樣本擴(kuò)增曲線呈斜直線型或橫直型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Kappa 一致性檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Kappa 系數(shù)越高，提示診斷一致性越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 不同方法在肺結(jié)核組中檢出結(jié)果比較 50 例肺結(jié)核組患者中LAMP 共檢出陽(yáng)性50 例，陽(yáng)性率為100.00%（50/50）；L-J 培養(yǎng)共檢出陽(yáng)性 39 例，陽(yáng)性率為 78.00%（39/50）。LAMP 結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性檢出率中高于L-J 培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.051，P=0.044），見表1～2。

2.2 診斷價(jià)值 LAMP檢查在診斷結(jié)核中靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值均高于L-J培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LAMP檢查與L-J培養(yǎng)診斷肺結(jié)核的特異度、準(zhǔn)確度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表1 肺結(jié)核組在LAMP檢查結(jié)核分歧桿菌陽(yáng)性中的檢查結(jié)果（n）

表2 肺結(jié)核組在L-J培養(yǎng)中結(jié)核分歧桿菌陽(yáng)性中的診斷價(jià)值（n）

表3 肺結(jié)核組在LAMP檢查及L-J培養(yǎng)結(jié)核分歧桿菌陽(yáng)性中的診斷價(jià)值（%）

3 討論

肺結(jié)核是臨床上常見的嚴(yán)重傳染病，在臨床疾病檢測(cè)中，將結(jié)核病列為重大傳染病的檢測(cè)范圍內(nèi)，故加強(qiáng)疾病的檢測(cè)對(duì)盡早診治呼吸道結(jié)核病具有重要意義。現(xiàn)階段，在診斷結(jié)核病中主要依靠結(jié)核桿菌培養(yǎng)基涂片抗酸染色，但在臨床操作中使用結(jié)核桿菌涂片抗酸染色檢出率較低，僅30%左右，無(wú)法及時(shí)檢出更多的結(jié)核病患者，加之結(jié)核桿菌的培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，周期約為12～26 d，故無(wú)法滿足臨床早期診斷結(jié)核病的要求[3-4]。

LAMP在檢測(cè)結(jié)核分支桿菌中無(wú)需昂貴、特殊設(shè)備，可在1 h內(nèi)對(duì)痰液標(biāo)本內(nèi)是否存在結(jié)核分支桿菌進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)結(jié)核分支桿菌上DNA上存在的6個(gè)區(qū)段，設(shè)計(jì)4個(gè)不同引物，同時(shí)在鏈置換反應(yīng)下大量擴(kuò)增目標(biāo)DNA，且其擴(kuò)增效率較高，可將靶序列擴(kuò)增至×109～1010倍[5]。因反應(yīng)液中加入了LAMP反應(yīng)核酸染料，當(dāng)溶液中出現(xiàn)大量的焦磷酸根時(shí)，則提示結(jié)核分枝桿菌為陽(yáng)性，溶液中的鎂離子將取代錳離子后與鈣黃綠素鰲合，此時(shí)可憑肉眼在日光燈下便可對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。若溶液中含有擴(kuò)增產(chǎn)物，則反應(yīng)混合物發(fā)生顏色變化；反之，則可保持橙色不變[6-7]。本研究結(jié)果顯示，50例肺結(jié)核組患者中LAMP共檢出陽(yáng)性50例，陽(yáng)性率為100%（50/50）；LJ培養(yǎng)共檢出陽(yáng)性39例，陽(yáng)性率為78.00%（39/50）。LAMP結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性檢出率中高于L-J 培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LAMP檢測(cè)在采樣時(shí)直接使用支氣管刷進(jìn)行采樣，可在直視條件下明確取材部位，操作可控性較好，在檢測(cè)病原菌中優(yōu)勢(shì)較明顯。LAMP 檢查與L-J 培養(yǎng)在診斷肺結(jié)核中并非完全一致，分析其原因在于LAMP檢查時(shí)，需將標(biāo)本行離心處理后再進(jìn)行檢測(cè)，而L-J 培養(yǎng)未進(jìn)行離心處理，從而造成載菌量存在差異，影響檢測(cè)結(jié)果；其次，LAMP 在測(cè)定結(jié)核分枝桿菌DNA時(shí)，無(wú)論活菌還是死菌均可檢出，而L-J培養(yǎng)僅可檢出活的結(jié)核分枝桿菌。此外，L-J培養(yǎng)時(shí)標(biāo)本需經(jīng)氫氧化鈉溶液處理，一定程度上影響結(jié)核分枝桿菌的活性，易導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌死亡，使得L-J培養(yǎng)陰性而LAMP檢查呈陽(yáng)性[8]。

綜上所述，LAMP 在診斷肺結(jié)核中結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性檢出率較高，具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，且靈敏度較高，可用于結(jié)核病早期的診斷。