miR-19b對H2O2誘導的大鼠心肌細胞H9c2氧化應激損傷的保護作用及機制研究

阮懷玉 廖小婷 曾彬

(武漢大學人民醫院心內科 武漢大學心血管病研究所 心血管病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060)

近年來，氧化應激在心血管疾病發展過程中的重要作用越來越受到關注，研究[1]表明氧化應激可引起心肌缺血、心肌缺血再灌注損傷以及心肌重構等一系列病理過程的發生，最終導致心肌細胞壞死和凋亡。心肌細胞是高度分化的細胞，不可再生，因此干預氧化應激和減少心肌細胞凋亡成為心血管疾病治療的研究熱點。最新研究發現，miRNA是心血管疾病重要的調控因子[2]，并且也已證明多種miRNA參與心血管疾病的發生和發展，如miR-26[3]、miR-21[3-4]和miR-221[5-6]等。近年來研究發現miR-19b在心力衰竭中低表達[7]，并可通過抑制心肌細胞凋亡和靶向BCL2L11/BIM來逆轉缺血性心力衰竭[8]，也與心肌梗死的發生密切相關[9]，但其對心肌細胞氧化應激的作用還少見報道。因此，本研究將探討miR-19b在H2O2誘導的大鼠心肌細胞H9c2損傷中的保護作用及具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌細胞H9c2由湖北省心血管病重點實驗室提供，高糖DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco公司，CCK8溶液和胰蛋白酶等購自Sigma公司，Lipofectamine 2000和Trizo試劑盒等購自Invitrogen公司，AnnexinV-FITC細胞凋亡試劑盒購自天津三箭技術有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)等檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 H9c2細胞的培養

(1)從-80 ℃冰箱中取出細胞迅速放入37 ℃水浴快速解凍，加入5 mL培養基重懸細胞并離心5 min。(2)棄去上清液，加入5 mL培養基重懸細胞接種于培養皿內，用含10%胎牛血清的DMEM培養液在37 ℃、5%CO2條件下培養。(3)當細胞融合到90%時進行傳代，后取處于對數生長期的細胞用胰蛋白酶處理后待用。

1.3 細胞分組與轉染

實驗分為6組：(1)空白對照組(L1組)：正常培養的H9c2細胞；(2)H2O2組(L2組)：H2O2(濃度400 μmol/L)處理2 h建立氧化損傷模型；(3)H2O2+miR-19b mimic陰性對照(NC)組(L3組)：轉染miR-19b mimic NC；(4)H2O2+miR-19b mimic組(L4組)：轉染miR-19b mimic；(5)H2O2+miR-19b inhibitor組(L5組)：轉染miR-19b inhibitor；(6)H2O2+miR-19b inhibitor NC組(L6組)：轉染miR-19b inhibitor NC。以上各組轉染后用H2O2處理2 h。

1.4 CCK8實驗

(1)將100 μL的細胞懸液配置在96孔板中并將其放在培養箱預培養24 h；(2)將6組待測物質各10 μL分別加在培養板內；(3)繼續將培養板在培養箱培養24 h；(4)向每孔分別加入10 μL CCK8溶液；(5)用酶標儀測定450 nm處吸光度。細胞活力(%)=[A(實驗孔吸光度)-A(空白孔吸光度)]/[A(對照孔吸光度)-A(空白孔吸光度)]×100。

1.5 RT-PCR法檢測miR-19b表達量

各組細胞轉染48 h后，總RNA用Trizol試劑提取并進行逆轉錄。用PCR試劑盒對miR-19b和U6進行熒光定量PCR擴增，以U6為內參對各組miR-19b的表達進行校正。反應體系總共20 μL，其中cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，qPCR試劑為10 μL，其余為ddH2O。反應條件為：在95 ℃溫度下，進行5 min的預變性，然后再95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，進行40個循環。計算miR-19b的相對表達量：△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因，由公式2-△△Ct計算的值代表了miR-19b的相對表達量。實驗共進行3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

取處于對數生長期的各組細胞接種于6孔板中，轉染24 h后，各組細胞分別離心、消化、收集，然后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次并離心棄去上清液。將200 μL結合緩沖液加入收集到的細胞沉淀中并將其吹打成單細胞懸液，加入5 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙啶試劑，輕柔搖晃使其混勻后在陰涼無光的條件下放置20 min后將其放入流式細胞儀檢測。

1.7 試劑盒檢測各組心肌細胞的SOD、LDH、MDA和GSH的表達水平

各個指標檢測按照試劑盒說明書進行操作。

1.8 Western blot法檢測核因子相關因子2和血紅素氧合酶-1蛋白表達

將裂解液加入6組細胞中并進行蛋白提純，后進行蛋白定量、電泳、轉膜，加5%脫脂牛奶在室溫條件下封閉1 h，然后用兔抗鼠核因子相關因子2(Nrf2)(稀釋度1∶500)以及兔抗鼠血紅素氧合酶1(HO-1)(稀釋度1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(稀釋度1∶10 000)室溫孵育1 h，化學發光法顯影。采用凝膠成像系統進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反映Nrf2和HO-1的表達水平。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 H2O2對H9c2心肌細胞活性的影響

結果顯示，隨著H2O2濃度的增加，對H9c2心肌細胞的損害越大，H9c2心肌細胞活性越低，細胞凋亡越多。結果如圖1所示。

注：與0 μmol/L H2O2比較，a：P<0.05,b：P<0.01。圖1 H2O2對H9c2心肌細胞活性的影響

采用0、100、200、400、600和800 μmol/L H2O2分別處理H9c2心肌細胞2 h，結果顯示，隨著H2O2濃度的增加，H9c2心肌細胞活性下降，差異有顯著性(P<0.01)。當H2O2的濃度為400 μmol/L時，細胞活性為64%，既能顯著抑制H9c2細胞活力，又不會使大量細胞凋亡，因此采用400 μmol/L的H2O2制作H9c2心肌細胞凋亡模型。

2.2 轉染后各組細胞內miR-19b的表達水平

與L1組(1.00±0.15)比較，L2組(0.16±0.04)和L3組(0.22±0.05)細胞中miR-19b表達量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與L2組及L3組比較，L4組(1.59±0.25)細胞中miR-19b表達量顯著升高，L5組(0.08±0.02)細胞中miR-19b表達量降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，L6組(0.19±0.05)細胞中miR-19b表達量未見統計學差異(P>0.05)。可說明miR-19b轉染成功，見圖2。

2.3 miR-19b對H2O2誘導的H9c2細胞活性的影響

與L1組(100%±10%)比較，L2組(61%±30%)和L3組(58%±21%)中細胞活性顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01)；與L2組及L3組比較，L4組(83%±29%)中細胞活性顯著升高，L5組(31%±17%)中細胞活性顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，L6組(55%±26%)中細胞活性未見統計學差異(P>0.05)。可說明miR-19b可提高由H2O2誘導的H9c2心肌細胞活性，見圖3。

注：a：與L1組相比，P<0.01；b：與L2組相比，P<0.01；c：與L3組相比，P<0.01。圖3 miR-19b對H2O2誘導的H9c2細胞活性的影響

2.4 miR-19b對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡的影響

與L1組(5.45%±0.40%)比較，L2組(35.50%±2.50%)和L3組(33.30%±2.15%)中細胞凋亡率顯著提高，差異具有統計學意義(P<0.01)；與L2組及L3組比較，L4組(7.57%±0.68%)中細胞凋亡率顯著降低，L5組(50.15%±5.10%)中細胞凋亡率提高，差異均有統計學意義(P<0.01)，L6組中細胞凋亡率(40.13%±3.10%)未見統計學差異(P>0.05)。可說明miR-19b降低由H2O2誘導的H9c2細胞凋亡率，見圖4。

2.5 miR-19b對H2O2誘導的H9c2細胞中SOD、LDH、MDA和GSH水平的影響

與L1組相比，L2組和L3組中細胞內SOD活力和GSH含量顯著降低，LDH活力和MDA含量顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.01)；與L2組及L3組相比，L4組中細胞內SOD活力和GSH含量顯著升高，LDH活力和MDA含量顯著降低，L5組中細胞內SOD活力和GSH含量顯著降低，LDH活力和MDA含量顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，L6組中細胞內SOD、LDH活力和MDA、GSH含量未見統計學差異(P>0.05)。說明miR-19b可升高細胞內SOD、GSH的表達量，降低LDH、MDA的表達量，見表1。

注：PI：碘化丙啶；FITC：異硫氧酸熒光素。圖4 miR-19b對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡的影響

表1 各組H9c2細胞中檢測指標結果比較

2.6 miR-19b對H2O2誘導的H9c2細胞中Nrf2和HO-1表達水平的影響

與L1組相比，L2組和L3組中Nrf2和HO-1表達水平顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.01)；與L2組及L3組相比，L4組Nrf2和HO-1表達水平顯著升高，L5組中Nrf2和HO-1表達水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。說明miR-19b可增強H2O2誘導的H9c2細胞中Nrf2和HO-1表達水平，見圖5。

3 討論

miRNA是一種微小的非編碼RNA分子，主要在轉錄后調節基因表達，參與細胞間的通訊[6，10]，并且在細胞增殖、分化、凋亡，甚至腫瘤發生等多種生物學過程中起到重要作用[11-12]，已逐漸成為生命科學領域的研究熱點。近年來，研究發現miRNA與心肌梗死、心律失常和心力衰竭等多種心血管疾病的發生和發展密切相關[13-15]。目前認為氧化應激是心血管疾病發生的重要因素[16]，進一步的研究也發現某些miRNA可通過調節氧化應激損傷水平來減緩甚至抑制心肌細胞凋亡的發生，如符麗珍等[17]研究發現下調miR-221表達來激活PTEN/Akt信號通路，進而抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡。鄭君毅等[18]研究顯示通過降低miR-1表達水平可減少H2O2誘導氧化應激引起的細胞凋亡。miR-19b是miR-17-92簇的主要成員之一，曾被認為與心臟的病理生理變化有關[19]。既往研究[20]也發現miR-19b可有效減緩糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變等一系列并發癥的發生，而這一作用也可能是通過提高機體的抗氧化能力實現的。因此，本研究進一步地探討miR-19在氧化應激相關的心肌細胞凋亡中的保護作用及其機制。

注：a：與L1組相比，P<0.01；b：與L2組相比，P<0.01；c：與L3組相比，P<0.01。圖5 miR-19b對H2O2誘導的H9c2細胞中Nrf2和HO-1表達水平的影響

在體內幾乎所有細胞在代謝過程中都會產生H2O2，且H2O2在體外性質相對穩定，較易獲得，故本實驗采用H2O2為工具建立氧化應激損傷模型來模擬體內氧化損傷的病理過程，但較高濃度的H2O2可直接導致細胞膜破裂，所以通過采用不同濃度的H2O2來誘導大鼠H9c2心肌細胞，結果發現伴隨著H2O2濃度的升高，大鼠H9c2心肌細胞活性呈現出逐漸降低的趨勢，故最終選擇400 μmol/L H2O2處理2 h建立體外心肌氧化應激損傷模型，并將其作為后續實驗誘導劑量。接著利用RT-PCR法檢測H2O2誘導的H9c2細胞中miR-19b的表達量，結果表明H2O2組中miR-19b表達量上升，與Xu等[21]研究結果一致，RT-PCR結果進一步表明miR-19b轉染的成功。研究接著利用流式細胞術及相關試劑盒檢測miR-19b對H2O2誘導的H9c2細胞活力及凋亡和相關氧化還原酶系的影響。本研究結果表明，與L1組比較，L2組、L3組以及L5組中H9c2細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著增加，而L4組中H9c2心肌細胞活性增加，細胞凋亡率顯著降低，這提示miR-19b對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡具有保護作用。與此同時，還發現在miR-19b保護心肌細胞抗氧化損傷的同時伴隨著細胞內LDH、MDA含量減少以及SOD、GSH水平的增加，這提示miR-19b可能通過調控與干預細胞內的氧化還原系統來減少H2O2引起的細胞內有害物質的過量堆積，同時增加SOD、GSH等抗氧化物質的含量，進而發揮保護心肌細胞的作用。

細胞凋亡是生命活動的基本現象，整個過程通常會涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用。既往研究[22]發現，Nrf2是機體抗氧化應激的重要核轉錄因子，屬于Cap-n-collar(CNC)轉錄因子家族成員，其激活后可啟動下游HO-1等多種抗氧化蛋白類基因的表達，從而調控遷徙、細胞生長、細胞凋亡以及轉錄等多種生理病理活動。當組織細胞處于缺血等多種應激狀態時，HO-1可通過Nrf2調控進行應答，其表達量迅速上升，從而表現出明顯的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用[23]。因此，近年來Nrf2/HO-1信號通路途徑在細胞凋亡與調控和減低心肌細胞凋亡中發揮的重要作用正備受關注[24]。最新研究[25]表明，Nrf2/HO-1信號通路在高糖誘導的心肌細胞氧化應激損傷中發揮著重要的保護作用。同時，還發現Nrf2/HO-1途徑主要是通過調控抗氧化酶系的表達等機制保護組織器官[26]。故本研究探討miR-19b是否會對H2O2誘導的H9c2細胞中Nrf2/HO-1信號通路產生影響，研究結果表明miR-19b能顯著上調H2O2誘導的H9c2細胞中Nrf2表達，上調HO-1表達水平，從而說明上調miR-19b表達可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，并調控下游蛋白表達，從而抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡。

綜上所述，miR-19b對H2O2誘導的心肌細胞的氧化應激損傷可發揮較好的保護作用，可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路以及調控細胞氧化還原系統來有效減少心肌細胞凋亡，并且本研究結果或對miR-19b治療心血管疾病及其他氧化應激損傷所致的疾病具有一定指導意義。