南蛇藤多萜通過抑制Chk1介導胃癌細胞DNA損傷并誘導其凋亡

姜壯壯，游 越，趙 陽，陶 麗，劉延慶

(揚州大學 1. 醫學院, 2. 國家中醫管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇 揚州 225009)

南蛇藤系為衛矛科植物南蛇藤的藤莖[1]，又名過山楓，含有多種藥理活性成份如萜類、皂苷類及脂肪類化合物等，具有祛風除濕、通經止痛、抗腫瘤、抗炎等多重藥理作用[2]。近年來課題組發現，南蛇藤對多種消化道腫瘤具有顯著的體內外抗腫瘤活性，同時對荷瘤小鼠的正常胃腸道、肝腎與造血機能無顯著的毒副作用[3]。通過活性追蹤、化學分離與結構鑒定，從中藥南蛇藤中開發研制南蛇藤多萜(the total terpenoids ofCelastrusorbiculatusThunb.，TTC)主要以五環二萜和三萜類化合物為主[4]。該有效組分對消化道腫瘤表現出較好的抗腫瘤活性，胃癌作為消化系統最常見的惡性腫瘤之一，對其研究多有報道[5-7]，但是其具體作用機制尚未明確。

細胞周期檢測點激酶1(checkpoint kinase 1，Chk1)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調節腫瘤細胞周期和DNA損傷應答及修復中發揮著關鍵作用[8]。當癌細胞DNA損傷后細胞的存活依賴于Chk1的激活并啟動DNA損傷修復系統，而Chk1被抑制時癌細胞則會失去對DNA損傷的反應和修復能力[9]。因此，抑制Chk1能使癌細胞對細胞毒性藥物敏感，已被證明是一個有前途的策略[10]。本研究旨在探討南蛇藤多萜對Chk1激酶活化的影響以及對胃癌細胞核內DNA完整性的影響，進一步闡明南蛇藤多萜抑制胃癌細胞增殖和誘導凋亡的機制，以期為南蛇藤多萜抗胃癌臨床研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及細胞培養人胃癌細胞株AGS，MKN-45細胞株購買于中國科學院上海細胞生物學研究所的細胞庫，細胞培養在含有10%胎牛血清和1%的抗生素混合物(100 mg·L-1鏈霉素和100 mg·L-1青霉素)的RPMI-1640培養基中。細胞在37 ℃、含5% CO2的恒溫培養箱中孵育。取對數生長期細胞以0.25%胰蛋白酶消化進行實驗。

1.2 藥物與試劑南蛇藤粉碎過篩后，用95%乙醇加熱回流提取3次，旋轉蒸發儀回收溶劑得到浸膏，真空低溫抽干，再用乙酸乙酯熱水浴加熱回流，過濾，回收得到乙酸乙酯浸膏。其主要成份為南蛇藤多萜(二萜類和三萜類)。二甲基亞砜(<0.05%)溶解，最后用培養基配成實驗所需要濃度工作液。使用的試劑包括:RPMI 1640細胞培養基(HyClone，USA)；胰蛋白酶(HyClone，USA)；胎牛血清(Gibco)；核蛋白提取試劑盒(上海生工化工技術，貨號：C500009)；二甲基亞砜(DMSO)；CCK-8(日本同仁，貨號：CK04)；BCA定量試劑盒(新賽美生物科技，貨號：WB6501)；抗體包括Chk1(CST，貨號：2360)；p-Chk1-Ser345(CST，貨號：2348)；γH2AX-Ser139(Sigma-Aldrich，貨號：05-636)；poly-PAR(Trevigen，貨號：4335-MC-100)；PARP1(CST，貨號：9542)，GAPDH(Abcam，貨號：ab8245)；Anti-Lamin A+Lamin C(Abcam，貨號：EPR4519)。

1.3 實驗儀器二氧化碳恒溫培養箱(Thermo Scientific公司，型號：3423)；酶標儀(PerkinElmer公司，型號：Enspire)；發光成像儀(Bio-Rad公司，型號：ChemiDox XRS)；穩壓DNA電泳儀(Bio-Rad 公司，型號：PowerPacTMBasic)；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，型號：BX61)。

1.4 CCK-8實驗取對數生長期人胃癌AGS、MNK-45細胞以5.0×103個/孔的密度接種在96孔板中。待細胞穩定后，給予不同濃度的TTC(20、40、80、160和320 mg·L-1)分別培養24、48和72 h。另設置陰性對照組(加入細胞和RPMI 1640培養液)和空白對照組(不加細胞，不加藥物，加入RPMI 1640培養液)。在各自培養時間段每孔加入10 μL的CCK-8溶液，使用酶標儀在490 nm處讀取反應溶液的吸光度值。

細胞抑制率/%=[(對照組吸光度-實驗組吸光度)/(對照組吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.5 克隆形成率實驗取對數生長期人胃癌AGS和MKN-45細胞以5.0×102個/孔接種于六孔板。接種后的d 4，用不同濃度的南蛇藤多萜(0、5、10 mg·L-1)的含藥培養基。每3 d換1次含藥培養基，藥物連續作用10 d后，用預冷的PBS溶液清洗細胞2遍，用含甲醇和冰乙酸(7 ∶1)的溶液固定細胞，然后用結晶紫(200 mg·L-1)染色。用肉眼觀察和手工計數克隆數(顯微鏡中大于10個細胞的克隆數)。

根據克隆形成率/%=克隆數目/接種細胞數×100%進行計算。

1.6 彗星實驗彗星電泳(comet assay)又稱為單細胞凝膠電泳，是一種在單細胞水平上檢測有核 DNA 斷裂的技術。使用彗星檢測試劑盒(Abcam，貨號：ab238544)，將75 μL已溶解的彗星瓊脂糖加到彗星載玻片中創建一個基底層。收集細胞在預冷的PBS(不含Mg2+和Ca2+)中調整細胞密度為每毫升約1.0×105個細胞。將細胞懸浮液與彗星瓊脂糖以1 ∶10的比例混合后取75 μL加到基底層中，在4 ℃冰箱中中靜置30 min使成凝膠，再將載玻片浸泡在預冷裂解緩沖液(2.5 mol·L-1NaCl、100 mmol·L-1Na2EDTA、10 mmol·L-1Tris、10% DMSO和1% Triton X-100, pH 10)中避光放置4 ℃冰箱中45 min。待細胞裂解后將載玻片置于預冷堿性溶液(0.3 mol·L-1NaOH, 1.0 mmol·L-1EDTA)中，4 ℃避光浸泡30 min。將載玻片浸泡在堿性電泳緩沖液(300 mmol·L-1NaOH和1.0 mmol·L-1Na2EDTA, pH=13)中進行DNA電泳(電泳條件25 V，30 min，另調節堿性電泳溶液的體積，使電流恒定在300 mA)。電泳結束后用75%乙醇脫水處理2遍，最后用1×Vista Green DNA染色液染色。然后用熒光顯微鏡觀察載玻片。DNA損傷是通過測量細胞核的遺傳物質(“彗星頭”)和產生的“尾巴”之間的位移來量化的。尾矩和拖尾DNA%是分析彗星試驗結果最常用的兩個參數。

通過CASPlab軟件定量熒光強度。

根據拖尾DNA/%=拖尾DNA強度/細胞DNA強度×100%進行計算。

1.7 Western blot實驗取對數生長期人胃癌AGS細胞和MKN-45細胞以1.0×104個/孔的密度均勻種植于六孔板中，放置于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中培養。加入不同濃度的南蛇藤多萜(0、25、50、100 mg·L-1)作用24 h后，細胞用預冷的PBS洗滌兩次，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液冰上裂解細胞20 min，以轉速為12 000 r·min-1離心10 min后提取細胞總蛋白。細胞核蛋白采用碧云天核蛋白提取試劑盒提取，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，然后在100 ℃條件蛋白變性5 min，用10%的SDS-PAGE分解相同數量的細胞裂解液(25 μg蛋白上樣量)，并轉移到PVDF膜上。質量分數為5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應抗體4 ℃孵育過夜，TBST溶液漂洗3次后加入相應的二抗(稀釋1 ∶5 000)，室溫孵育2 h后TBST漂洗3次，于凝膠成像系統下成像。

2 結果

2.1 南蛇藤多萜對AGS與MKN-45細胞的毒性影響CCK-8實驗檢測不同濃度的南蛇藤多萜(20、40、80、160、320 mg·L-1)對AGS和MKN-45細胞的生長抑制情況。結果顯示，南蛇藤多萜在24 h、48 h、72 h對AGS細胞的IC50分別是421.1、99.68、58.57 mg·L-1；對MKN-45細胞的IC50分別是308.2、124.1、68.21 mg·L-1,見Fig 1和Tab 1。表明南蛇藤多萜能夠有效地抑制胃癌細胞的增殖。

Fig 1 Growth inhibition rates of TTC in AGS andMKN-45 cells at different

GC cell lineIC50(TTC, mg·L-1)24 h48 h72 hAGS>32099.6858.57MKN-45308.2124.168.21

2.2 南蛇藤多萜能夠抑制AGS和MKN-45細胞的克隆形成采用克隆形成率實驗進一步研究在低濃度下長期給予TTC對胃癌細胞生長的影響。連續分別給予0、5、10 mg·L-1的南蛇藤多萜10 d(每3 d換1次含藥培養基)。然后給予冷甲醇固定30 min，棄去固定液加入質量分數為0.5%結晶紫(溶于25%甲醇)染色液，染色30 min，清水輕柔洗滌后拍照。結果如Fig 2所示，隨著給藥濃度逐漸增加，AGS和MKN-45細胞的克隆形成明顯減少。統計結果如Fig 2所示，5、10 mg·L-1的南蛇藤多萜對AGS細胞的克隆形成抑制率分別為29.67%和61.46%，對MKN-45細胞的克隆形成抑制率分別為42.73%和64.39%。

Fig 2 Cloning and inhibition of AGS cells bydifferent concentrations of

2.3 南蛇藤多萜加重胃癌細胞的DNA損傷采用彗星實驗檢測TTC對胃癌細胞核中DNA損傷情況。如Fig 3所示，空白對照組中胃癌細胞AGS和MKN-45的DNA結構完整，細胞核大小均一，經熒光染色后呈現圓形狀的熒光團且強度均勻，無明顯的拖尾現象。隨著南蛇藤多萜濃度的增加,胃癌細胞核DNA斷裂的碎片或堿變性片段增多，彗星尾長相應增加,尾部熒光強度也相應增強，呈現一定的劑量效應關系。同時，為了確定南蛇藤多萜的安全性，選取了人正常胃粘膜上皮細胞作為對照。統計結果如Fig 3，25 mg·L-1、50 mg·L-1和100 mg·L-1給藥組與空白對照組相比，DNA均有不同程度的損傷且各檢測指標值均顯著增加(P<0.05)，而對于人正常胃粘膜細胞GES-1的DNA幾乎無損傷，差異無統計學意義。

2.4 Western blot檢測AGS和MKN45細胞中DNA損傷蛋白、細胞周期檢查點蛋白以及細胞凋亡等相關蛋白表達影響給予不同濃度的南蛇藤多萜(0、25、50、100 mg·L-1)處理24 h后提取細胞核蛋白，Western blot檢測不同濃度的南蛇藤多萜對胃癌細胞DNA損傷相關蛋白表達的影響。結果顯示，隨著南蛇藤多萜濃度的增加，DNA單雙鏈斷裂標志蛋白Poly-PAR、γH2AX表達均增加，見Fig 4。隨后，檢測了細胞周期檢查點蛋白Chk1的蛋白表達情況，結果顯示，隨著TTC濃度的增加Chk1沒有變化，但是其磷酸化蛋白水平被抑制，見Fig 5-6。說明Chk1蛋白的活性被抑制。最后，檢測了細胞凋亡相關蛋白cleaved-PARP1表達情況，結果顯示，cleaved-PARP1的蛋白表達水平增加。表明南蛇藤多萜抑制了細胞損傷檢查點Chk1的激活而導致DNA損傷的累積，最終導致細胞凋亡。

Fig 3 Cometary imaging of DNA damage induced by TTC in AGS cells at different concentrations(

Fig 4 Effects of TTC at different concentrations on expression of nuclear proteinPoly-PARs and γ-H2AX in AGS and MKN-45 cells(n=3)

Fig 5 Effects of TTC at different concentrations on expression of Chk1 and PARP1 in AGS and MKN-45 cells(n=3)

Fig 6 Effect of TTC on expression level of Chk1phosphorylated protein under different action time

3 討論

據流行病學統計，胃癌依舊是我國最致命的惡性腫瘤之一，每年導致30多萬人死亡[11-12]。目前，胃癌的治療方案主要包括手術治療和化療，但一些接受手術治療的患者可能存在腫瘤復發，同時長期使用化療藥可能會導致耐藥的發生，故并未顯著提高胃癌患者整體生存率，因此，迫切需要尋找能夠阻斷多種致癌途徑的藥物靶點，從而為晚期胃癌治療提供更多可能性[13-14]。基因組DNA作為真核生物最重要的遺傳物質，其分子結構的完整和穩定性對細胞的存活及行使正常生理功能具有決定性作用[15]。有研究表明，南蛇藤提取物之一南蛇藤素可誘導癌細胞的DNA損傷，并增加癌細胞對基因毒性化學物質的敏感性[16]。DNA損傷的積累可能是由于DNA的復制壓力增加或修復能力下降所引起。ATR-Chk1信號對持續性DNA損傷通過細胞凋亡和有絲分裂突變誘導細胞死亡至關重要。信號傳導通路中的上游基因ATR能夠感受DNA損傷信號，在每個斷裂部位產生大量的p-Chk1[17]，本研究結果揭示了南蛇藤多萜具有一種新的活性，即抑制Chk1的激酶活性，而抑制ATR-Chk1信號通路則造成癌細胞子代DNA損傷積累，同時總的Chk1并未發生變化。該研究還發現南蛇藤多萜抑制Chk1磷酸化激活呈現劑量依賴性和時間依耐性。細胞周期檢查點的抑制則導致DNA單雙鏈斷裂標志蛋白Poly-PAR、γH2AX表達均增加，最終復制性的損傷災難則導致胃癌細胞誘發凋亡，即PARP羧基端的催化結構域(89 ku)和氨基端的sbDNA結合結構域(24 ku)相分離，從而使PARP失去其酶活力成為Cleaved PARP，最終誘導癌細胞走上凋亡。綜上，南蛇藤多萜可能通過抑制Chk1而加速胃癌細胞AGS和MKN-45的DNA的災難性損傷最終誘導胃癌細胞增殖抑制和凋亡。此結論對南蛇藤多萜抗胃癌臨床治療效益和安全性具有一定的臨床前意義，使得具有潛在基因毒性的中藥南蛇藤提取物有望作為一種Chk1抑制劑的天然開發產物。