表面活性素的國內外研究進展

李光月，胡文鋒，李雪玲*

（華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

隨著各個行業的發展，世界對表面活性劑的需求逐年增加。有研究表明，2015-2022年期間，全球表面活性劑銷量增長率為5.4%，銷售額增長率為5.9%；到2020年，全球表面活性劑市場將達到427億美元，市場總量將達到2 280.2萬t[1]。目前，應用化學表面活性劑較多，但存在環境污染這一潛在問題。綠色、無污染以及高效性表面活性劑成為工業領域的重要發展方向。

表面活性素（surfactin）是一種極具前景的微生物表面活性劑，只需少量劑量就可以使溶液體系界面狀態發生明顯變化。表面活性素可由多種細菌，真菌和酵母通過非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPS）的多酶復合物合成，為兩親性分子[2]。自ARIMA K等[3]首次發現表面活性素后，其結構、合成方式、特性、功能等就不斷被發掘。在結構上，由于表面活性素的脂肪酸部分如長度、飽和、分支或羥基化和肽鏈中氨基酸的類型和序列不固定，可以有多個組合，常以多個同系物的混合形式共存于細胞中[4]。表面活性素具有高發泡能力、低生態毒性、溫和的生產條件以及在極端的pH，鹽度和溫度下具有較高的穩定活性等優點，且具有高度的生物降解性，具有巨大的商業價值[5]。然而，表面活性素的低的生物合成效率和高生產成本限制了其工業化生產。本文綜述了表面活性素的生物合成、定量分析、分離純化技術以及應用來展望其未來的發展，為后期的研究提供參考。

1 表面活性素的生物合成

作為一種有效的生物表面活性劑的非核糖體肽，表面活性素并不是純凈物，而是一種可變分子質量同工型的復雜混合物，其基本結構是由手性序列LLDLLDL和C12-19β-羥基脂肪酸相互連接，形成環狀內酯環結構。疏水氨基酸殘基位于2、3、4、6和7位，而谷氨酸（glutamic acid，Glu）和天冬氨酸（aspartic acid，Asp）分別在1和5位向分子引入兩個負電荷[6]。盡管表面活性素在結構上存在異質性，有多個同系物，但其生物合成模式是一樣的。與蛋白質中的多肽鏈相反，表面活性素不是通過mRNA模板在核糖體上翻譯形成的，而是通過以模塊方式構建特殊的非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPS）形成的。表面活性素的合成主要分為兩個部分：前體物質（脂肪酸和氨基酸）的生物合成和表面活性素的組裝。

微生物通過攝取相關營養物質（如碳源、氮源等），通過初級代謝（如糖酵解、三羧酸循環、磷酸戊糖途徑、蛋白質代謝、脂質代謝等）合成前體，在這個過程同時也為后面的表面活性素合成提供能量。隨后，NRPS通過多載體巰基化模板機制開始合成表面活性素。NRPS由四個酶亞基組成，分別是酶SrfA（402 kDa），SrfB（401 kDa）和SrfC（144 kDa），SrfD（40 kDa），它們構成7個模塊（每個模塊主要由腺苷酰化結構域、肽酰載體蛋白（peptidyl carrier protein，PCP）結構域和縮合結構域3個核心結構域組成），每個模塊負責識別、激活和裝載單個氨基酸底物[7]。NRPS的N-末端L-Glu活化模塊能夠結合β-羥基脂肪酸底物并將其連接至起始氨基酸L-Glu，從而啟動表面活性素的生物合成，其余氨基酸通過NRPS多酶復合體經過腺苷酰化、縮合反應進行氨基酸的活化和肽鏈的延伸。表面活性素的生物合成根據多載體巰基化模板機制，組成七肽的所有氨基酸均通過逐步活化和負載單個氨基酸底物來進行。表面活性素起始模塊啟動后，NRPS裝配線從延伸模塊C-A-PCP開始[8]：①底物氨基酸和新生肽鏈通過4'-磷酸泛酰疏基乙胺（4'-phosphopantethein，Ppant）部分被束縛在NRPS上；②A結構域從可用底物庫中特異性選擇氨基酸，在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、Mg2+參與下將其激活為氨基酰-一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）；③活化的氨酰基-AMP隨后被轉移到相鄰的PCP上，并作為硫酯與Ppant輔因子結合；④C結構域催化與相鄰PCP結構域共價結合的兩個中間體之間的肽鍵形成。但是在模塊3和6中發現兩個差向異構域（催化與巰基化結構域（thiolation domain，T domain）結合的氨基酸的外消旋作用），分別將左旋-亮氨酸（L-Leu）轉化為右旋-亮氨酸（D-Leu）。而在最后一個模塊的C-末端存在一個硫酯酶（thioesterase，TE）結構域，負責催化最終的七肽作為大內酯的環化和釋放[8]。

表面活性素的前體物質是通過細胞初級代謝獲得的，但是，細胞初級代謝產物并不僅僅提供給表面活性素的合成，也會被用于各種細胞生物質的合成，比如細胞膜、酶等。因此，表面活性素的生物合成會于細胞的其他物質合成構成競爭初級代謝產物。由此可見，如果利用基因工程或其他分子技術針對表面活性素的生物合成途徑來提高其產量[9]，可以通過控制細胞代謝途徑或過量表達其相關合成基因，使其獲得充足前體物質。如與分泌相關的基因swrC的過表達在枯草芽孢桿菌THY-7中將表面活性素效價提高了約1.5倍，而基因swrC和acrB的過表達在枯草芽孢桿菌168中將表面活性素效價提高了70%[10]。規律間隔成簇短回文重復序列干擾（clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference，CRISPRi）介導的氨基酸生物合成分支代謝途徑中的16個基因的阻遏導致枯草芽孢桿菌產生多達0.75 g/L表面活性素[11]。

2 表面活性素的定量分析

目前，表面活性素主要通過微生物發酵生產，高產菌株的選育是研究的重點和關鍵，因此，建立篩選模型可以降低表面活性素產生菌篩選的工作量。目前篩選方法大多建立在表面活性素表界面特性基礎上。不管是傳統的定量分析方法，如酸沉比濁法、油滴擴散法和油滴塌陷法等，還是高通量定量分析方法，如溴百里香酚藍-氯化十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride-bromothymol blue，CPC-BTB）比色法、聚二乙炔法和高效液相色譜法等都存在其優缺點，因此，常采用兩種及兩種以上的定量分析方法進行生產菌株的篩選。比如，可以通過乳化試驗，液滴崩塌試驗，奧西諾爾試驗，藍瓊脂試驗和原油置換試驗來篩選產生生物表面活性劑的細菌[12]。當然，也有些研究是在現有定量分析方法的基礎上研發出新的高通量篩選方法，如使用一種新的自動靈敏的熒光檢測方法篩選出芽孢桿菌產脂肽菌株[13]。目前幾種常見的表面活性素定量分析方法見表1。

表1 表面活性素的定量分析方法Table 1 Quantitative analysis methods for surfactin

續表

3 表面活性素的分離純化

由于表面活性素的回收和濃縮占總生產成本的60%～80%，因此，選擇成本更低以及損耗更低的分離純化方法就顯得尤為重要。表面活性素的分離純化方法常基于其電荷性質，溶解度特性，位置（細胞內、細胞外、細胞結合）以及回收和下游加工的經濟性等因素綜合選擇。表面活性素分離純化比較傳統的方式是酸沉淀，溶劑萃取，結晶，硫酸銨沉淀和離心，泡沫分離，超濾和聚苯乙烯樹脂上的吸附-脫附以及離子交換色譜是后面研究比較新穎的分離純化方法。一般來說，為了獲得純化產物，采用一系列分離純化步驟進行產物回收的多步回收策略比單一分離純化步驟更為有效，所以，在很多研究中，會出現多種分離純化方法交替使用以獲得純度更高的產物，減少損耗。如在提取枯草芽孢桿菌KLP2015中的表面活性素后，通過硫酸銨沉淀，纖維素膜袋透析，二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纖維素柱和尺寸排阻色譜法進行純化，純化倍數為2.18[26]。在很多研究中，表面活性素的部分純化基本上會通過酸沉淀和甲醇萃取法聯用進行的[27]。表2列舉了目前幾種常見的表面活性素分離純化的方法。

表2 常見表面活性素分離純化方法Table 2 Isolation and purification methods for surfactin

4 表面活性素的應用

4.1 食品領域

在食品研發、加工、儲藏過程中，除了要注意食品原料、加工工藝、食品包裝和保藏方法的選擇之外，食品添加劑的選擇使用也值得重視。表面活性素是一類最主要的食品添加劑，廣泛用于各類食品生產，其用量雖少，但在提高食品質量、改進生產工藝、延長食品保質期，提高生產效率等方面效果顯著[35]。表面活性素主要作為食品乳化劑、消泡劑、制糖助劑、清洗劑和水果剝皮劑等出現在食品領域中，其中應用最廣泛的是食品乳化劑[36]以及防腐劑[37]。GOMES M ZD V等[38]報道了使用表面活性素去除食物病原體生物膜的方法，發現用0.25%表面活性素進行預處理可將單核細胞增生李斯特菌和腸炎沙門氏菌的粘附力降低42.0%。

4.2 日用品及化妝品

作為一種含有降低表面張力的疏水和親水部分的兩親性分子，表面活性素具有乳化、洗滌、發泡、增溶、殺菌、潤濕、滲透、分散等特性，并具有承受極端環境條件的能力，這有助于疏水成分在產品中的增溶以及通過皮膚屏障的傳遞[39]。表面活性素這種低刺激性和高皮膚相容性的強大優勢是市面上化學表面活性劑所沒有的。因此表面活性素在日用品和化妝品領域的使用率很高，成為許多產品配方的重要組成部分，比如洗面奶、潤膚乳液、護膚霜、洗發水、護發素、牙膏等。FEI D等[40]報道了表面活性素在洗滌劑配方中作為低毒性和無刺激性的生物表面活性劑的性能。口服毒性試驗和皮膚刺激性試驗表明，表面活性素適用于商業洗滌劑，同時在乳化性、潤濕性、發泡性和穩定性方面也表現出優異的表面和界面特性。

4.3 醫藥領域

表面活性素是兩親性膜活性肽抗生素，通過其疏水部分與細胞膜相互作用，具有強大的抗微生物、抗炎、抗病毒、抗支原體和抗癌活性，表現出顯著的醫學應用價值，可作為合成藥物和抗菌劑的合適替代品[41]。另外，表面活性素具有抗粘附性能，可抑制生物膜的生成，抑制細菌與感染部位的粘附，為治療傷口以及皮膚疾病提供了依據[42]。LIU J等[43]的研究結果表明，表面活性素對細菌的粘附和固體表面生物膜的形成具有明顯的抑制作用，并直接破壞成熟的生物膜。表面活性素的這種作用可能具有潛在的生物醫學應用，特別是在外科手術裝置和植入物中。據報道表面活性素（枯草芽孢桿菌產生的環狀脂肽）抑制腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌或變形桿菌在尿道導管上形成生物膜而不會影響細胞生長，并誘導預先形成的生物膜分散[44]。另外一篇研究中發現了枯草芽孢桿菌AC7產生的脂肽（主要是表面活性素和較低的豐霉素）顯著阻止醫用級有機硅彈性盤上白色念珠菌的的初始沉積并減緩生物膜的生長，這表明生物表面活性劑涂層在預防與硅酮醫療器械相關的真菌感染方面的潛在作用[45]。裝載有表面活性素的聚乙烯醇納米纖維可改變單核細胞增多性李斯特菌與聚苯乙烯的粘附力，存在表面活性素納米纖維的情況下，單核細胞增生李斯特氏菌與聚苯乙烯的粘附力顯著降低，表明這些納米纖維可用于傷口敷料或修復裝置的涂層中，以防止生物膜形成和繼發感染[46]。

4.4 石油領域

表面活性素可減少碳氫化合物-水界面的張力，從而使碳氫化合物假增溶，增加遷移率，達到提高石油采收率的目的[47]。表面活性素還可與油水界面緊密結合，從而形成乳液，這樣可以穩定水中的脫附油，并與注入的水一起去除油，這能夠用于漏油、清洗油罐中污泥和原油回收[48-49]。市場上生產的絕大多數表面活性素都用于石油相關應用產品，比如頁巖抑制劑、酸化緩蝕、脫（除）硫、減阻劑、緩蝕劑、分散劑、防蠟劑、破乳劑、脫硫劑。HADIA N J等[50]評估了枯草芽孢桿菌生物體生產的凍干表面活性素提取物在提高采油率應用中作為化學表面活性劑的替代品的潛力。通過測量兩種輕質原油和水相之間的界面張力，發現表面活性素在時其界面張力顯著降低。同時，巖心驅油實驗表明，通過表面活性素驅油可提高約1.7%～5.0%的采收率。另外一篇研究開發了表面活性素作為一種新型的pH可切換的生物破乳劑，可有效分離油，從廢原油中回收超過95%的油[51]。

4.5 農業領域

在農業領域使用化學藥品和殺蟲劑控制節肢動物通常會產生不良影響，對環境或人類產生不利影響，而表面活性素具有抗菌、抗真菌和殺蟲活性的優勢，因此表面活性素在農業領域具有不可忽視的應用前景[52-54]。除此之外，表面活性素也可用于獲得良好的潤濕性并實現肥料在土壤中的均勻分配，或者用作先導化合物以開發新型生物農藥[55]，或直接用作生物理性產品來控制植物病原性真菌[56-57]。近年來，由于表面活性素其對多種病原體的廣泛抗菌活性及其獨特的作用方式，可作為常規抗生素的替代品并用于病蟲害防治[58]。HUSSAIN T等[59]的研究中發現存在于Bacillus subtilisHussainT-AMU的培養濾液中的表面活性素，對病原體Rhizoctionia solani有非常顯著的影響，并觀察到塊莖產量和植物生長的增加。LI Y等[60]的研究中證明含有表面活性素枯草芽孢桿菌上清液對霜霉病具有很高的活性，并且該活性來自對病原體的直接作用和對植物防御的刺激（防御基因表達的誘導和call的產生）。

5 展望

毋庸置疑，表面活性素具備著化學表面活性劑所沒有的絕對優勢，在各個工業領域中有著不可預料的應用潛力。但是，就目前而言，表面活性素的生產上有許多基于實驗室的成功，但在工業化生產上還是一個挑戰，因為其低生物合成效率以及高下游加工成本還未能使表面活性素大規模生產。表面活性素還有待進一步的探索研究：

（1）表面活性素生物合成模式較為復雜，同系物較多，妨礙了其提高產量、應用以及后期的研究。因此需要對表面活性素的分子結構，細胞內合成機理等進行更深一步的研究，這樣才能根據結構性質，更好地應用于各個行業；

（2）表面活性素的生產成本仍然遠遠高于化學表面活性劑，以至于表面活性素的生產過程在經濟上是不可行的。因此，未來將繼續加大研究提高產量和回收率的新穎策略（如菌種改良、使用廉價的底物、優化發酵參數、工藝設計和降低下游成本），將實驗室層面上的成功過渡到工業層面上，逐漸研發出更多性能優越的新產品，逐漸向專業化、規模化的方向不斷發展；

（3）盡管表面活性素在生物醫學上具有巨大的潛力，但其應用仍然有限，對其分子作用模式缺乏了解以及對人體有機體的毒性尚不清楚。進一步的研究應探討表面活性素對人體細胞的影響和毒性，必須進行支持性研究才能證明其在幾個生物醫學和健康相關領域的潛力。表面活性素的全部潛力被充分開發并應用于醫學只是時間問題。