細菌纖維素合成菌的篩選、鑒定及其產物結構和性質表征

李婷婷，趙 鑫，任葉琳，任佳楠，韓雪容*

（長春理工大學 生命科學技術學院，吉林 長春 130022）

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是微生物生產的類似于纖維素的由D-吡喃葡萄糖單體以β-1,4-糖苷鍵聚合而成的胞外直鏈高分子多糖；該多糖由直徑3～4 nm的微纖維組成40～60 nm纖維束交織形成超精細3D納米網狀結構[1]。細菌纖維素這種獨特高分子結構和超細3D納米結構[2]，使其具有高持水能力[3]、高聚合度[4]、高機械強度[5]、高結晶度[6]等優異性能。如細菌纖維素膜抗撕拉能力是等厚度聚乙烯膜、聚氯乙烯膜的6倍[7]；其高吸水持水能力，經100 ℃干燥后的再溶脹能力與短棉絨相當[8]；其聚合度和結晶度均高于大多數植物纖維，具有更穩定的物理力學和熱學性質[9]；另外，細菌纖維素還具有生物相容性、生物可降解性，可以將其用于傷口敷料以及組織工程支架的開發[10]，是一種新型環境友好型生物材料。目前，細菌纖維素作為諸多傳統合成材料的代替品，在生物醫學、造紙、化妝品、環境污染治理以及食品制造等多個領域具有廣闊的應用前景[11]。

細菌纖維素自1886年BROWN A J[12]首次報道以來，因其優異的材料性能越來越受到廣泛關注，尤其是在細菌纖維素合成菌株篩選、鑒定[5]，細菌纖維素合成機理及調控機制[10]，細菌纖維素發酵工藝優化生產[13]，細菌纖維素表面改性[14]等方面研究報道較多。然而，目前細菌纖維素由于生產菌種單一、合成產率低、合成碳源成本高等原因，仍難以滿足應用市場對細菌纖維素材料的需求[15-16]。

為解決以上問題，本研究以含糖量較多的腐敗葡萄為篩選源，篩選、分離鑒定高產細菌纖維素菌株，并通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）、傅立葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，FT-IR）、凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）、X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）等觀察、分析測試手段鑒定獲得菌株合成膜的微觀結構、分子表面的官能團特性、分子質量分布特征以及結晶度等，為后續細菌纖維素的規模發酵生產研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

腐敗葡萄（產地：中國新疆）：市售。

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉（均為生化試劑）：英國OXOID公司；葡萄糖、十二水合磷酸一氫鈉、氯化銨、氫氧化鈉、無水乙醇、五氧化二磷、硫酸、硝酸、碳酸鈉、二甲基亞砜（均為分析純）：北京化工廠；熒光增白劑：美國Sigma公司；檸檬酸（分析純）：上海源葉生物公司；五氧化二磷（分析純）：上海阿拉丁（Aladdin）公司。

1.1.3 培養基

富集培養基采用馬血清（horse serum，HS）液體培養基：葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物5 g/L，Na2HPO42.7 g/L，檸檬酸1.15 g/L，蒸餾水；滅菌條件為120 ℃，20 min。

HS平板篩選培養基：HS液體培養基中加入1～3 μg/mL熒光增白劑和15 g/L瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

FB224電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；ZHJH-C1109B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、HPX-9162MBE電熱恒溫培養箱：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；DW-86L626立式超低溫保存箱：海爾集團；BOX EF-E凝膠成像系統：香港基因有限公司；JY-ECP3000電泳儀北京君意東方電泳設備有限公司；Life Touch TC-96/G/H聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：杭州博日科技股份有限公司；5424R高速冷凍離心機：德國艾本德股份公司；DMXY系列光學顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司；Sigma500場發射掃描電鏡：德國蔡司公司；L1600400傅立葉紅外光譜儀、Bruker D8 X射線衍射儀：德國Bruker（布魯克）公司；Waters1515凝膠滲透色譜儀：美國Waters公司。

2.2.3 缺乏有效的護患溝通和知識宣教。護士未落實責任制整體護理,往往重視患者的病情,而忽視了對患者的相關知識宣教和心理評估。長期置管患者對管道的自我管理警惕性下降,7例患者中2例T管脫出均是來院拔管的患者。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株篩選

將腐敗葡萄放入HS液體培養基（30 mL）中，30 ℃靜置培養1～3 d，選用液體表面產生纖維素凝膠膜的發酵液保存待用。

1.3.2 菌株分離純化

取上述從膜上擠壓的發酵液進行濃度梯度稀釋后（10-2、10-4、10-6、10-8、10-10），用各濃度梯度的稀釋液100 μL分別在平板篩選培養基上進行涂布，30 ℃靜置培養16～24 h，挑取在紫外燈下發熒光的單菌落接種到富集培養液中再次富集培養。重復進行上述操作6次，至平板篩選培養基上呈現形態一致的單菌落。

1.3.3 菌株特征觀察

菌落形態觀察：觀察記錄培養3～5 d的篩選平板培養基中的菌落形態，包括菌落色澤、形狀、大小、透明度等。

革蘭氏染色：滴一小滴蒸餾水于干凈的載玻片上，按無菌操作法用接種環取少許菌體，涂于水滴內并做好標記，涂勻，干燥，加熱固定；待涂片冷卻后，先滴加結晶紫染色1 min，用水沖去染液，瀝干，再滴加碘液媒染1 min，去碘液，水洗；以體積分數95%的乙醇脫色20～30 s，水洗，最后滴加番紅復染2～3 min，水洗，干燥，鏡檢[17]。

生理生化特征：進行接觸酶、乙醇氧化成酸[18]、乳酸鹽氧化成CO2和H2O[19]、乙酸鹽氧化成CO2和H2O[20]、甘油轉酮、葡萄糖生酮、丙二酸利用[21]、D-山梨醇產酸、麥芽糖產酸、甘露醇產酸、阿拉伯糖利用、Frateu's Hoyer的生長等項目的檢測[22]。具體操作參照《伯杰系統細菌學手冊》。

1.3.4 菌株生物學分類

篩選菌株的16S rDNA擴增：利用該菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）為模版，細菌16SrDNA通用引物1492 R：5'-GGTTAC CTTGTT ACGACT T-3'，27F：5'-AGAGTT TGATCC TGGCTC AG-3'，通過PCR反應擴增菌株的16S rDNA。擴增程序：94 ℃、5 min，94 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃、1 min，72 ℃、7 min，循環數30。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收并純化PCR樣品送至吉林庫美公司進行測序。將該菌株16S rDNA提交到美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）與其他細菌進行比較，用MEGA 6.0軟件構建其分子系統進化樹，確定該菌株具體生物學分類。

1.3.5 合成物結構表征

菌株的培養及合成物提取：擴大培養規模至100 mL，在30 ℃、7～10 d培養后，取產生的菌膜經蒸餾水多次沖洗至菌膜表面無雜物及培養基后，將其置于0.5%的NaOH溶液中，放入100 ℃烘箱中處理2 h，待其冷卻后再用蒸餾水多次沖洗至呈中性，瀝干水分并進行凍干處理后得到干膜。

檢測分析：掃描電鏡觀察（SEM）、吸水性、紅外光譜檢測（FT-IR）、凝膠滲透色譜（GPC）、X射線衍射（XRD）等。

2 結果與分析

2.1 篩選純化結果

以腐敗葡萄作為篩選源，經6次平板涂布篩選得到一株細菌纖維素合成菌，將其命名為菌株ZX C6-15。

2.2 菌株特征

2.2.1 菌落形態學觀察

由圖1A可知，菌株ZX C6-15單菌落呈乳白色、圓形、略微隆起、表面光滑、不產色素、產酸。由圖1B可知，經革蘭氏染色制片后光學顯微鏡（10×100）下看到該菌呈短桿狀、單個或成對，顏色反應呈紅色，說明ZX C6-15菌株為革蘭氏陰性菌。由圖1C可知，在紫外燈下發熒光、菌落直徑大約為0.5 mm。

圖1 菌株ZX C6-15菌落形態（A）、細胞形態（B）及紫外觀察結果（C）Fig.1 Colony morphology (A),cell morphology (B) and ultraviolet observation results (C) of strain ZX C6-15

2.2.2 生理生化檢測

對菌株ZX C6-15進行生理生化特征檢測結果見表1。由表1可知，該菌株與醋酸菌類似，對接觸酶、阿拉伯糖利用、乙醇氧化成酸、甘油轉酮、葡萄糖生酮等反應結果呈陽性，乳酸鹽氧化成CO2和H2O、乙酸鹽氧化成CO2和H2O、丙二酸利用、D-山梨醇產酸、麥芽糖產酸、甘露醇產酸、Frateu's Hoyer的生長等反應結果呈陰性。

表1 菌株ZX C6-15的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain ZX C6-15

2.3 菌株生物學分類結果

菌株ZX C6-15的16S rDNA序列全長為1 362 bp，分子系統進化樹見圖2。由圖2可知，菌株ZX C6-15與Acetobacter syzygiistrain SZCPY4：KU555381.1相似性達到100%，屬于醋酸菌屬，因此將其鑒定為醋酸菌屬（Acetobactersp.）ZX C6-15（NCBI登錄號為：MT355921.1）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株ZX C6-15系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZX C6-15 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 菌株ZX C6-15產膜的結構和性質表征

2.4.1 SEM觀察

由圖3可知，Acetobactersp.ZX C6-15菌株產膜的掃描電鏡圖中，菌膜表面有少許殘留物，纖維細而長，微纖維互相交叉、纏繞、折疊形成密集網狀結構，這種超微纖維網結構決定了細菌纖維素的高持水性。產物掃描電鏡結果與文獻[23]中的細菌纖維素結構類似。

圖3 醋酸菌ZX C6-15產膜的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy image of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.4.2 吸水率檢測

菌株Acetobactersp.ZX C6-15產膜干燥后膜的吸水率測定結果見表2。

表2 醋酸菌ZX C6-15產膜的吸水率測定結果Table 2 Determination results of water absorption rate of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

由表2可知，該菌產膜的吸水率高于細菌纖維素模式菌株ATCC23769的吸水率，達到298%。結果表明，該菌株提取的產物具有良好的吸水性能，取決于產物具有的網狀納米纖維結構。

2.4.3 FT-IR檢測

菌株Acetobactersp.ZX C6-15合成的樣品進行紅外光譜檢測結果見圖4。由圖4可知，波數3 352 cm-1處峰型寬且較強的為O-H鍵吸收峰；波數2 918 cm-1處為C-H鍵吸收峰；波數1 625 cm-1處為纖維素4'端半縮醛基吸收峰；波數1 159 cm-1處為C-O鍵吸收峰，與模式菌ATCC23769產ATCC-BC所含有的官能團基本吻合，也與MACHADO R T A等[24]的研究結果相符。結果表明，Acetobactersp.ZX C6-15菌株產生膜是細菌纖維素。

圖4 醋酸菌ZX C6-15產膜的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectrum of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.4.4 凝膠滲透色譜檢測

Acetobactersp.ZX C6-15菌株產膜Aceto-BC樣品和模式菌株ATCC23769產膜ATCC-BC樣品進行GPC檢測。將細菌纖維素樣品于硝酸和硫酸混酸溶液中硝化后，蒸餾水洗滌數遍，使用5%碳酸鈉溶液浸泡中和后，蒸餾水煮沸30 min。將樣品取出，使用無水乙醇浸泡1 h后過夜烘干。取適量處理后的細菌纖維素樣品溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中進行檢測，分子質量標準品為聚甲基丙烯酸酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA），檢測結果見表3。由表3可知，菌株ZXC6-15產膜的重均分子質量（Mw）為14.1×104kDa，數均分子質量（Mn）為32.3×104kDa，分散度為2.28。對比細菌纖維素模式菌ATCC23769的產物，重均分子質量增加，分散度降低，表明該菌株合成的細菌纖維素的聚合度更高，平均粒徑尺度更均勻。

表3 醋酸菌ZX C6-15菌株產膜的分子質量分析Table 3 Molecular mass analysis of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.4.5 X射線衍射檢測

菌株Acetobactersp.ZX C6-15產膜樣品Aceto-BC和ATCC-BC進行XRD檢測，結果見圖5。由圖5可知，在2θ=14.64°，16.48°和22.74°處出現三個主要特征峰，分別對應于Ⅰ型纖維素的（1-10），（110）和（200）晶面[25]，表明Aceto-BC屬于纖維素Ⅰ型晶體結構。經計算，Aceto-BC的結晶度指數為96%，高于ATCC-BC的結晶度指數82%。生物高分子的結晶度決定其纖維的形態、材料的分解溫度、拉伸強度等材料性能[26]，該細菌纖維素具有如此高的結晶度表明其具有良好材料性質。

圖5 醋酸菌ZX C6-15產膜的X射線衍射圖Fig.5 X-ray diffraction spectrum of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.5 討論

本研究從水果中分離、純化得到能產膜的菌株ZX C6-15的生理生化分析結果表明該菌株具有接觸酶和甘油轉酮活性，但不具有甘露醇產酸、丙二酸利用以及麥芽糖產酸活性，說明菌株ZX C6-15與產酸的醋酸菌區別較大[27-28]。本研究得到的菌株ZX C6-15盡管與Acetobacter syzygiiSZCPY4具有很高的同源性，但可能是合成細菌纖維素的屬于醋桿菌的較新菌種。采用SEM、FT-IR、XRD、GPC等檢測手段對該菌株產膜的分析結果表明，該膜與模式菌株ATCC23769所產細菌纖維素類似，具有比模式菌纖維更致密的3D網狀結構，且具有細菌纖維素典型基團的特征吸收峰。對比模式菌株ATCC23769所產細菌纖維素，菌株ZX C6-15合成細菌纖維素數均分子質量、分散度、結晶度和吸水率更高，表明該細菌纖維素的分子質量的均度更好，具有更優秀的材料性質。

3 結論

本研究以腐敗葡萄作為篩選源，經篩選、分離純化得到一株能夠合成細菌纖維素且傳代穩定性良好的菌株；該菌株可能屬于醋酸菌屬的較新菌種，命名為Acetobactersp.ZX C6-15；對比細菌纖維素模式菌ATCC23769，該菌株合成產物具有更致密的典型細菌纖維素3D納米網狀結構和分子官能團吸收；合成產物細菌纖維素的重均分子質量為14.1×104kDa，分散度為2.28，結晶度為96%，吸水率為218%，均高于模式菌ATCC23769生產的細菌纖維素，表明Aceto-bactersp.ZX C6-15所產細菌纖維素具有優良的理化性質和機械性能。