高產Monacolin K的青稞功能紅曲發酵工藝優化研究

郝 靜，涂兆鑫，紀鳳娣，劉 煜，2，吳 晶，張成萍，張建玲，魏 巍*

（1.青海華實科技投資管理有限公司，青海 西寧81000；2.青海華實青稞生物科技開發有限公司，青海 西寧 810000；3.青海省青稞資源綜合利用工程技術研究中心，青海 西寧 810000；4.北京市營養源研究所，北京 100069）

紅曲是我國先民的一項偉大發明，在我國和世界微生物學開發與利用發展史上具有極其重要的意義，是我國傳統藥食同源的寶貴發明和科學文化遺產[1]。傳統功能紅曲是以大米為原料，用紅曲霉發酵而成，含有Monacolin K、紅曲色素、γ-氨基丁酸和多糖等多種重要的代謝產物[2-3]，其中Monacolin K是紅曲中重要的營養功能成分[4]，有閉環的內酯式和開環的β-羥基酸式兩種結構，具有降血脂、降血壓和降血糖[5-6]等功效。

青稞是我國高原特色農作物，其蛋白質、淀粉、纖維素和維生素等營養成分含量高，同時還含有酚類物質、甾醇類物質和膳食纖維等功能成分[7-8]。它具備紅曲霉生長的基礎營養條件，制備出的青稞紅曲發酵物具有許多功能成分，在食品領域有很好的應用[9]。目前國內青稞紅曲產品的開發研究處于起步階段，只有少數企業及學者對青稞紅曲進行研究。胡久平等[10]通過對青稞紅曲高溫發酵溫度、低溫發酵溫度、發酵濕度的優化，得到一條Monacolin K含量達1.94%的生產工藝；周禮紅等[11]研究了青稞紅曲發酵工藝對色價的影響，通過優化青稞蒸煮時間、料水比、裝料量、發酵時間、發酵溫度、接種量、初始pH值等工藝參數，得到的青稞紅曲米色價高達1 210.84 U/g；譚有莉等[12]對青稞紅曲的性狀、顯微特征、水分、灰分、浸出物、薄層鑒別和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析等進行研究，并在此基礎上初步制定了青稞紅曲的質量標準。西藏月王生物技術有限公司的青稞紅曲系列產品受到了廣泛的肯定和關注。

為了充分利用青稞，開發出高附加值的青稞衍生產品，本研究以二道脫皮青稞代替大米進行固態發酵，通過對發酵工藝條件的優化提高Monacolin K的含量，以期豐富功能紅曲的種類，拓展青稞的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肚里黃青稞：青海華實投資管理有限公司；叢毛紅曲（Monascus pilosus）：北京市營養源研究所保藏；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato detroxse agar，PDA）培養基、蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：北京陸橋技術股份有限公司；葡萄糖、硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、冰醋酸、磷酸等（均為分析純）：北京化工廠；甲醇（色譜純）：美國Fisher scientific公司；洛伐他汀（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司。

基礎培養基：青稞米飯；種子培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基；液體培養基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨25 g/L，硝酸鈉2 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，乙酸調節pH值為5.0。以上培養基滅菌條件為121 ℃，15 min。

1.2 儀器與設備

LDZX-30FBS滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；FCH-1300B超凈臺：北京亞泰科隆儀器技術有限公司；MJ-500-Ⅱ霉菌培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；Hitachi CF16RN高速冷凍離心機：日本日立公司；Vanquish-H高效液相色譜儀（配置二極管陣列檢測器）：美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 功能紅曲發酵工藝及操作要點

操作要點：青稞米清洗后浸泡至中間無白心，瀝水20 min至表面干燥，上屜蒸飯20 min，攤涼后添加營養成分，分裝三角瓶（160 g/500 mL），121 ℃滅菌15 min，冷卻后接種液體紅曲霉種子（菌落數1×107CFU/mL），降溫培養，高溫發酵2 d，低溫發酵21 d，培養過程中適時補加pH4.0乙酸水，出曲后60 ℃干燥至水分10%以下。

1.3.2 菌種培養及發酵方法

菌種活化及保藏：將保藏菌種劃線接種于PDA斜面上，30 ℃培養7～8 d，至菌絲體長滿斜面并變成紅色后，4 ℃冰箱保存。

種子培養：用無菌水反復沖洗叢毛紅曲菌斜面，制成孢子懸液，并稀釋至1×104CFU/mL，接種到裝液量為150 mL/500 mL PDA液體培養基中，30 ℃，200 r/min空氣搖床中培養48 h。

固態發酵培養：青稞浸泡至無白心，瀝水20 min，蒸飯20 min，攤涼，分裝三角瓶，滅菌，接種量10%，放入培養箱培養，每天扣瓶2次，適時補加乙酸水溶液。

1.3.3 菌株生長曲線測定

以試驗用菌種為研究對象，利用液體培養基，采用稱量菌絲干質量的方法，繪制叢毛紅曲菌的生長曲線，確定最佳接種時間。

1.3.4 培養基成分優化單因素試驗

蛋白胨添加量優化：基礎培養基中分別添加0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%（以干質量計）的蛋白胨，考察不同蛋白胨添加量對Monacolin K產量的影響。

酵母粉添加量優化：基礎培養基中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%（以干質量計）的酵母粉，考察不同酵母粉添加量對Monacolin K產量的影響。

磷酸二氫鉀添加量優化：基礎培養基中分別添加0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%（以干質量計）的磷酸二氫鉀，考察不同磷酸二氫鉀添加量對Monacolin K產量的影響。

1.3.5 發酵條件優化單因素試驗

考察不同青稞米浸泡水初始pH值（3、4、5、6、7）、青稞蒸煮時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）、裝料量（120 g/500 mL、140 g/500 mL、160 g/500 mL、180 g/500 mL、200g/500mL）、接種量（4%、6%、8%、10%、12%，以青稞米飯質量計）、高溫發酵溫度（28℃、30℃、32℃、34℃、36℃）、低溫發酵溫度（23℃、25℃、27℃、29℃））對MonacolinK產量的影響。

1.3.6 發酵工藝優化正交試驗

根據單因素試驗所得發酵條件，選擇發酵溫度、菌種接種量和初始pH為影響因素，以Monacolin K含量為考察指標，進行L9（34）正交試驗，因素與水平編碼如表1所示。

表1 發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

1.3.7 指標測定方法

（1）Monacolin K含量檢測方法

依據QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》對青稞功能紅曲中的Monacolin K進行檢測，對檢測條件進行了適當改進。具體條件為：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm×5μm）色譜柱，柱溫25 ℃；流動相為0.12%的磷酸水溶液（A）和甲醇（B），流速為1.0 mL/min，流動相梯度洗脫程序為：0～20 min，B=77%；22min，B=100%；25min，B=77%；25～30min，B=77%；檢測波長為238nm。Monacolin K含量按如下公式計算：

式中：X1為試樣中Monacolin K的含量，mg/g；h1為試樣中內酯型洛伐他汀峰面積；h2為試樣中內酯型洛伐他汀峰面積；c為標準洛伐他汀（內酯）溶液質量濃度，mg/mL；50為試樣定容體積，mL；h3為標準洛伐他汀（內酯）溶液峰面積；m為試樣稱取量，g。

Monacolin K（以絕干計）按如下公式計算：

式中：X為試樣中Monacolin K含量（以絕干計），%；X1為試樣中Monacolin K的含量，mg/g；X2為試樣中水分的含量，%。

（2）水分含量測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》。

2 結果與分析

2.1 Monacolin K測定高效液相色譜圖

圖1為青稞功能紅曲樣品中Monacolin K含量測定的高效液相色譜圖。由圖1可知，青稞紅曲中Monacolin K酸式、內酯式完全分離，峰形良好，所得結果為兩者之和。

圖1 青稞功能紅曲樣品中Monacolin K高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Monacolin K in functional highland barley Monascus sample

2.2 菌種生長曲線

以叢毛紅曲菌為研究對象，考察32 ℃恒溫搖床培養不同時間的菌絲干質量。培養時間對菌絲干質量的影響如圖2所示。

圖2 從毛紅曲霉生長曲線Fig.2 Growth curve of Monascus pilosus

由圖2可知，保藏菌種在培養第36～48小時菌絲迅速增加，此時霉菌酶系活躍，代謝旺盛，細胞群體的形態與生理特性最一致，微生物細胞抗不良環境的能力最強[13-14]。48～60 h為穩定生長期，但增長速度減緩。為節約時間成本，選取最適宜接種時間為液體培養48 h。培養時間過短，菌種量少、生長緩慢，培養時間過長，菌種衰老，不利于Monacolin K的積累。

2.3 培養基成分優化單因素試驗

由圖3可知，Monacolin K產量隨著磷酸二氫鉀、蛋白胨、酵母粉的添加量增加均呈現先升高后降低的趨勢。磷酸二氫鉀添加量為0.3%時，叢毛紅曲霉產生Monacolin K含量達1.32%；蛋白胨添加量為0.6%時，Monacolin K含量達1.30%；酵母粉添加量為0.3%時Monacolin K含量達1.06%。分別為各條件下最高。

圖3 不同培養基成分添加量對Monacolin K產量的影響Fig.3 Effect of different additions of medium components on Monacolin K yield

2.4 發酵條件優化單因素試驗

2.4.1 不同青稞米浸泡水初始pH值對Monacolin K產量的影響

由圖4可知，青稞米初始pH值為5、6和7時，紅曲中Monacolin K含量較低，在pH值為4時含量最高，這是因為紅曲霉菌是喜酸型菌，最適宜生長的pH值為3～5，在pH＜3時生長緩慢，在pH≥5時，不利于色素合成。因此，初始pH值為4時最適宜。

圖4 不同初始pH值對Monacolin K產量的影響Fig.4 Effect of different initial pH on Monacolin K yield

2.4.2 不同青稞蒸煮時間對Monacolin K產量的影響

由圖5可知，蒸煮時間為20 min及以上時，紅曲Monacolin K的含量無明顯差異。蒸煮的主要作用是使青稞米中的淀粉糊化，便于微生物利用。隨著蒸煮時間的延長，青稞米黏度及水分含量增加，綜合考慮時間成本、能耗及試驗的可操作性，選擇20 min為最佳蒸煮時間。

圖5 不同蒸煮時間對Monacolin K產量影響Fig.5 Effect of different cooking time on Monacolin K yield

2.4.3 不同裝料量對Monacolin K產量的影響

由圖6可知，裝料量為120 g/500 mL時，所得Monacolin K的含量為1.38%，裝料量為160 g/500 mL時，含量為1.31%，裝料量為180 g/500 mL時，含量僅為1.16%。在紅曲霉發酵過程中，Monacolin K的生成受培養基水分含量、內部溫度及氧氣含量影響很大[15]。培養基過少，不利于水分的保持，并且隨著發酵時間的延長，米粒逐漸干硬，影響叢毛曲霉正常生長[16]；培養基過多，不利于紅曲菌體代謝過程中所產生的熱量散失，同時也不利于氧氣流通，同樣會影響生長，繼而影響Monacolin K的合成，導致其含量降低。裝料量120 g/500 mL與160 g/500 mL Monacolin K的含量沒有明顯的差異，為了獲得更高的產量，選擇160 g/500 mL為最優。

圖6 不同裝料量對Monacolin K產量的影響Fig.6 Effect of different loading capacity on Monacolin K yield

2.4.4 不同接種量對Monacolin K產量的影響

由圖7可知，在接種量＜10%時，所得紅曲中Monacolin K的含量隨著接種量的增加而逐漸增加，在10%時Monacolin K含量最高，超過10%時Monacolin K含量降低。這是因為接種量過低，菌體繁殖緩慢，接種量過高，菌體過快增殖而積累的大量代謝產物對發酵過程會產生反饋抑制作用，還會使發酵基質的黏度增加，叢而妨礙傳質過程，最終影響菌體生長和代謝產物的生成[17]。

圖7 不同接種量對Monacolin K產量的影響Fig.7 Effect of different inoculum on Monacolin K yield

2.4.5 不同發酵溫度對Monacolin K產量的影響

功能紅曲的發酵工藝采用變溫發酵，高溫培養階段是為了積累生物量[18]，低溫培養階段是Monacolin K的合成累積的重要時期[10]。李同樂等[14]以大米為基質發酵生產功能紅曲米時采用30 ℃下培養3 d后降溫26 ℃培養15 d的工藝，張占軍[19]等也用了相同的工藝。本文根據叢毛紅曲霉的特性提高了高溫發酵的溫度，縮短高溫發酵時間至2 d，降低了低溫發酵溫度，延長低溫發酵時間至21 d，更有利于Monacolin K的生產。

由圖8可知，在不同高溫發酵溫度下青稞紅曲中Monacolin K的含量先升后降，32 ℃時Monacolin K產量最高，32 ℃為最適宜紅曲霉菌生長的溫度，此時生物量積累最多。在不同的低溫發酵溫度下，青稞紅曲中的Monacolin K含量先升后降，25 ℃時Monacolin K含量較高，為1.18%。在低溫培養條件下，紅曲霉生長緩慢且向基質內部生長，營養物質不斷被消耗用于積累代謝產物。同時，紅曲霉經變溫刺激由生長期轉為穩定期，次級代謝產物開始大量生成[20]。因此確定高溫發酵和低溫發酵的溫度分別為32 ℃和25 ℃。

圖8 不同發酵溫度對Monacolin K產量的影響Fig.8 Effect of different fermentation temperature on Monacolin K yield

2.5 發酵條件優化正交試驗

由單因素試驗所得最優的發酵條件，選擇發酵溫度（A）、菌種接種量（B）和初始pH值（C）為影響因素，以Monacolin K含量為考察指標進行3因素3水平的正交試驗，結果見表2，方差分析見表3。

表2 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表2及表3可知，發酵溫度對Monacolin K含量的影響顯著（P＜0.05），對Monacolin K產量的影響因素的主次順序是A＞C＞B，即發酵溫度＞初始pH值＞接種量。最優方案是A3B2C2，即最優的發酵工藝為發酵溫度34 ℃、接種量10%和初始pH值為4.0。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，獲得Monacolin K的產量為1.52%。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiments

2.6 質量指標

依據QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》對青稞功能紅曲米的感官指標（外觀、斷面和香味）、理化指標（水分和Monacolin K含量）和衛生指標（鉛、砷、菌落總數、霉菌和橘霉素等）進行檢測，結果見表4和表5。由表4和表5可知，青稞紅曲的質量指標均符合規定。

表4 青稞功能紅曲米理化指標Table 4 Physical and chemical indexes of functional highland barley Monascus

表5 青稞功能紅曲米衛生指標Table 5 Health indicators of functional highland barley Monascus

3 結論

本試驗對青稞功能紅曲發酵的工藝進行了優化試驗，通過單因素試驗和正交試驗，獲得了高產Monacolin K的青稞功能紅曲生產工藝，確定的最優發酵工藝條件為：青稞米用初始pH值為4.0的水浸泡至無白心后蒸煮20 min，以裝料量160 g/500 mL分裝，添加0.6%蛋白胨、0.3%酵母提取物和0.3%磷酸二氫鉀，接種10%培養48 h的液體菌種，采用降溫發酵，32 ℃發酵2 d后降溫至25 ℃發酵21 d，適時補加pH值為4.0乙酸水溶液，可以得到Monacolin K產量1.52%的青稞功能紅曲米。本研究為青稞功能紅曲的大規模生產和Monacolin K的進一步研究提供了參考，有利于青稞相關衍生新產品的開發。