張家界市酸魚細菌類群解析及其功能預測

席 啦，凌 霞，劉長玲，楊 江，張振東，郭 壯*

（1.湖北文理學院湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北襄陽 441053；2.襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北襄陽 441001）

酸魚是侗族和苗族等少數民族制作的一種特色食品，因其口感美味和營養豐富而廣受歡迎[1]。酸魚是在密封環境下自然發酵而成的，主要原料為新鮮的淡水魚，包括青魚、草魚和鯽魚等[2]，制作過程大致為清洗原料魚、放置腌料（腌料的主要成分為胡椒、辣椒、小米、鹽、糖和酒等）和裝壇發酵，樣品需要經過至少半個月的時間進行發酵[3]。民間傳統的發酵方法不僅需要較長的發酵周期，且發酵標準和產品品質無法得到保障，這制約了傳統發酵食品的現代化和工業化發展。為改善這種情況，BAO R等[4]通過研究發現接種乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）M10和食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）M3可在降低發酵周期的同時保持發酵魚的品質，且二者還能增強發酵魚風味的形成；ZANG J H等[5]對酸魚發酵過程中微生物群落的多樣性進行了研究，發現酸魚在發酵過程中細菌和真菌的結構是隨著發酵時間而變化的，且在相同的發酵環境中，真菌的多樣性大于細菌的多樣性；夏秀東等[2]發現添加辣椒可抑制酸魚發酵前期的菌落數量，并減少發酵過程中揮發性鹽基氮的含量，但是具體的影響機制還仍待討論。目前有關酸魚的研究仍相對較少，并且對成品酸魚的群落細菌多樣性及功能預測分析還尚未開展。

近幾年來，隨著高通量測序技術的快速發展，以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測序技術因具有測序成本低、操作簡單和結果準確等特點[6-7]而被廣泛關注和使用，目前在酸奶[8]、臘魚[9]、風干豬肉[10]、泡菜[11]和辣椒醬[12]等方面均有所應用。隨著人們對16S rRNA序列認識的深入和高通量測序技術的發展，研究者發現基于16S擴增子分析所獲得的信息相對有限，因此研究者開始探討如何將分類單元操作（operational taxonomic unit，OTU）與細菌基因組功能建立聯系，于是PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）技術應運而生，自此為16S擴增子的相關研究提供了研究方向，近幾年來已被廣泛的用于土壤[13]和食品[14]微生物類群揭示及其功能預測分析。

本研究從湖南省張家界市采集7 個酸魚樣品，采用Illumina MiSeq測序技術對其細菌多樣性進行了解析，用PICRUSt技術對其微生物基因功能進行預測，以期為后續酸魚生產用微生物菌株篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸魚：采集自湖南省張家界市慈利縣，樣品編號分別為SY1、SY2、SY3、SY4、SY5、SY6和SY7。

脫氧核糖核苷三磷酸、10×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）酶：北京全式金生物技術有限公司；338F/806R正反向引物：武漢天一輝遠生物科技有限公司；微生物基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

Vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；R930機架式服務器：美國DELL公司；Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；FluorChem FC3化學發光凝膠成像系統：美國ProteinSimple公司；CR21N型高速離心機：日本日立金屬株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集及細菌基因組DNA提取

樣品采集自湖南省張家界市慈利縣慈利大市場、城西農貿市場和生活家菜市場，選取以草魚和紅辣椒為原料、發酵20～30 d左右且采用土陶壇發酵的酸魚，裝入采樣袋后置于裝有冰袋的樣品箱。7個酸魚樣品由不同農戶手工制作，樣品運送回實驗室后去除魚頭和魚刺，魚肉使用組織攪拌機打碎后，使用基因組提取試劑盒進行微生物宏基因組提取。

1.3.2 細菌16S rRNA擴增及高通量測序

以基因組為模板，使用帶有7 個核苷酸序列的338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物，參照王玉榮等[15]的擴增體系對細菌16S rRNA序列V4-V5區進行PCR擴增，結束后進行檢測和清潔。使用Illumina MiSeq PE300平臺進行高通量測序。參照ZHANG W等[16]的方法將下機序列進行拼接，并按照王玉榮等[17]的方法進行序列質量控制，進而得到質量控制合格的有效序列。

1.3.3 生物信息學分析

將質控合格的有效序列上傳至QIIME分析平臺進行生物信息學分析。其主要分析流程如下：（1）使用PyNAST軟件對序列進行校準與對齊處理[18]。（2）使用UCLUST算法分別按照100%和97%對序列進行OTU的建立[19]。（3）使用ChimeraSlayer去除含有嵌合體序列的OTU。（4）將每個OTU中第一條序列分別與Greengenes、RDP和SILVA數據庫[20]進行比對分析，以便在門、綱、目、科和屬水平上對酸魚樣品的細菌群落進行分析，進而計算超1（Chao1）和香農（Shannon）指數。

1.3.4 PICRUSt基因功能預測

將合格的高質量序列與Greengenes數據庫進行比對，用PICRUSt軟件[20]對酸魚的基因功能進行預測，然后基于蛋白質直系同源簇數據庫[21]（Clusters of Orthologous Groups of proteins，COGs）進行功能注釋。

1.3.5 數據分析

用SAS軟件進行相關性分析，用R軟件進行UpSet圖、相關性圖和熱圖的繪制，其他圖形都是采用Origin8.6軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 樣品序列多樣性及豐富度分析

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術對7個酸魚樣品的細菌群落結構進行了解析。序列經過質控后，7個酸魚樣品共產生了274 102條高質量序列，平均每個樣品39 157條。經與16S rRNA標準數據庫比對得到274 098條序列，其中有4 條序列比對失敗，因而共有274 098條序列參加分類單元操作劃分。7個酸魚樣品的測序結果以及分類學地位如表1所示。

表1 酸魚樣品測序結果及各分類地位數量Table 1 Sequencing results of sour fish and number of classified positions

由表1可知，樣品SY3的超1指數最高，而樣品SY1的香農指數最高，這說明樣品SY3中細菌的豐富度最大，而樣品SY1中細菌的多樣性最高。由表1亦可知，按97%相似性進行分類單元操作劃分共得到3 612個OTU，平均每個樣品1 218 個，在分類單元操作劃分的基礎上，將所有序列劃分為7個門、19個綱、64個目、94個科和148個屬。

2.2 基于各分類學地位酸魚細菌相對含量的構成分析

本研究將酸魚樣品中平均相對含量＜1.0%的細菌歸為其他，基于門水平細菌構成情況如圖1所示。

圖1 酸魚樣品中平均含量高于1.0%的細菌門Fig.1 Bacteria phylum with average content higher than 1.0% in sour fish samples

由圖1可知，平均相對含量高于1.0%的有3 個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為95.49%、2.29%和1.96%，其中有0.2%鑒定不到門序列。酸魚樣品中平均相對含量＞1.0%的細菌屬構成如圖2所示。

圖2 酸魚樣品中平均含量高于1.0%的細菌屬Fig.2 Bacteria genera with average content higher than 1.0% in sour fish samples

由圖2可知，酸魚中平均相對含量大于1.0%的細菌屬主要有隸屬于Firmicutes的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）和乳球菌屬（Lactococcus），其平均相對含量分別為66.53%、11.77%、8.10%、3.07%和2.99%；隸屬于Actinobacteria的棒狀桿菌屬（Corynebacterium），其平均相對含量為2.20%；隸屬于Proteobacteria的醋酸桿菌屬（Acetobacter），其平均相對含量分別為1.15%。Lactobacillus、Tetragenococcus和Lactococcus均為乳酸菌，三者的累計平均相對含量為81.29%，由此可見，酸魚樣品中蘊含了豐富的乳酸菌。單玉鑫等[22]通過對貴州和湖南地區酸魚微生物群落結構與品質的聯系研究發現，酸魚產品的主要優勢細菌為Lactobacillus和Tetragenococcus，研究結論與本研究相同。Halanaerobium是一種嗜鹽且嚴格厭氧的細菌，其可利用碳水化合物和果膠等物質來產酸和產氫，李春生等[23]研究魚露發酵過程中細菌的演替以及品質變化，發現Halanaerobium會通過抑制乙酸乙酯的生成進而促進三甲胺的釋放，從而可能會導致發酵產品產生魚腥味，降低品質。

游剛等[24]研究表明使用復合乳酸菌發酵劑可以增加六齒金線魚肉中醇、醛和酮類物質的含量，降低胺類物質的產生，進而改善了產品的風味品質；鄭心如等[25]亦評價了復合發酵劑對發酵魚肉香腸品質的影響，研究發現使用復合發酵劑可顯著降低總揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值，同時使得氨基酸態氮（amino acid nitrogen，AAN）值顯著升高，進而使得產品品質提高。由此可見，為了縮短發酵時間、提高產品品質和提升發酵魚產品的安全性，在對酸魚樣品中優勢細菌屬進行分析的基礎上，對其中的優勢類群進行分離，同時對優良發酵特性菌株進行篩選并確定其最佳的發酵復配方案，進而實現乳酸菌發酵劑在酸魚生產中的應用是一個比較可行的研究思路。

本研究進一步對酸魚樣品中OTU的含量及分布情況進行分析，結果如圖3所示。

圖3 基于OTU水平的UpSet圖Fig.3 UpSet diagram based on OTU level

由圖3可知，有76 個OTU存在于所有的樣品中，共包含188 289條序列，占序列總數的68.69%；同時分別有563、300、198、75和50個OTU僅存在于SY1、SY4、SY3、SY7和SY5樣品中，分別包含了5 270、1 136、678、269和159條序列，分別占總序列數的1.92%、0.41%、0.25%、0.10%和0.06%。由此可見，7 個酸魚樣品中存在大量的核心細菌類群，雖然部分樣品可能含有特殊的細菌類群，但其相對含量較少。將在所有樣品中均存在的OTU定義為核心OTU，進一步分析發現其中8 個核心OTU的相對含量大于1.0%，其結果如圖4所示。

由圖4可知，8 個核心OTU被注釋為3 類細菌屬，其分別為Lactobacillus、Tetragenococcus和Staphylococcus。OTU11996注釋為Tetragenococcus，其平均含量為9.89%，OTU4509、OTU5083、OTU3571、OTU7361、OTU1144和OTU11972均注釋為Lactobacillus，其平均含量分別為1.11%、1.18%、1.42%、1.45%、1.95和43.27%，OTU6717注釋為Staphylococcus，且其平均含量為5.50%。值的一提的是，注釋為乳酸菌的7 個核心OTU平均含量累計達60.27%，由此可知，乳酸菌在酸魚中為主要的優勢菌，這和圖2的結論是一致的。進一步對核心OTU之間的相關性進行研究，結果如圖5所示。

圖4 平均相對含量大于1.0%的核心OTUFig.4 Core OTU with average relative content higher than 1.0%

圖5 核心OTU之間的相關性Fig.5 Correlation between core OTUs

由圖5可知，OTU7361（鑒定為Lactobacillus）與OTU4509（鑒定為Lactobacillus）的相關系數為1.00，相關性極顯著（P＜0.001）；OTU7361（鑒定為Lactobacillus）與OTU1144（鑒定為Lactobacillus）的相關系數為0.87，相關性非常顯著（P＜0.01）；OTU4509（鑒定為Lactobacillus）與OTU1144（鑒定為Lactobacillus）的相關系數亦為0.87，相關性亦非常顯著（P＜0.01）。由此可見，酸魚樣品中部分Lactobacillus類群可能具有一定的共生關系。

2.3 PICRUSt功能預測

本研究使用PICRUSt軟件對酸魚中細菌微生物的基因功能進行預測，同時參考蛋白質直系同源簇數據庫（COGs）對功能類別進行了注釋，其結果如圖6所示。

圖6 酸魚樣品細菌的功能預測Fig.6 Functional prediction of bacteria in sour fish samples

由圖6可知，從納入本研究的7個酸魚樣品中分析得到4 048個COG，且其隸屬于21個功能類別，其中“氨基酸轉運與代謝”和“碳水化合物運輸和代謝”等功能在酸肉細菌類群中表達較高，而“RNA的加工與修飾”、“染色質結構與動力學”、“細胞周期控制、細胞分裂、染色體分割”、“細胞壁/膜/包膜生物發生”、“次生代謝產物的合成轉運和分解代謝”和“細胞骨架”等功能表達則相對較低。

3 結論

使用Illumina MiSeq技術對張家界市7個酸魚樣品進行細菌多樣性解析發現，優勢細菌門為Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria，三者累計相對含量可達99.74%，優勢細菌屬主要為Lactobacillus、Tetragenococcus、Staphylococcus、Halanaerobium、Lactococcus、Corynebacterium和Acetobacter，相對含量占細菌屬的95.81%。酸魚樣品中含有大量的Lactobacillus、Tetragenococcus及Lactococcus核心類群，含量占總細菌類群的60%左右，且其細菌類群具有較強的氨基酸和碳水化合物轉運與代謝功能。