賒店老酒酒醅中高產纖維素酶菌種的分離鑒定及產酶條件優化

劉延波，劉洋洋，趙志軍，吳俊儀，王 賢，潘春梅，孫西玉*

（1.河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院（酒業學院），河南 鄭州 450046；2.河南仰韶酒業有限公司博士后創新實踐基地，河南 澠池 472400；3.河南牧業經濟學院 河南省白酒風格工程技術研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業經濟學院 鄭州市白酒釀造微生物技術重點實驗室，河南 鄭州 450046；5.賒店老酒股份有限公司，河南 社旗 473300；6.河南張弓老酒酒業有限公司，河南 寧陵 476733）

濃香型白酒是中國白酒銷售市場的主力，具有窖香濃郁、綿柔醇厚、香味和諧、尾凈余長的特征[1]。濃香型白酒的制作主要是以酒醅和窖池為基礎，依靠大曲、窖泥和空氣中的一些微生物在白酒釀造的窖池中進行極其龐大的物質與能量代謝的流程。酒醅是釀制白酒的原料經過微生物融合后發酵的物質，也是酒精發酵過程中物質能量代謝最活躍的反應中心[2]。在白酒的窖池環境中，酒醅充當著信息傳導、物質循環和能量流動的“三流運行”定律的介質[3]。酒醅之中的揮發性成分則直接影響著白酒酒體的口感與風味[4]。

纖維素是由β-葡聚糖苷鍵將葡萄糖相連接而成的多聚糖，其降解需內切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三種酶的協作作用，才能夠將其分解為葡萄糖，這一原理廣泛應用于工業制造中[5-6]。白酒發酵的酒醅中含有許多種類的產生纖維素酶的菌株，它們所形成的纖維素酶對于白酒的生產品質起著十分關鍵的作用，其不僅能夠影響到白酒中的有機酸、酯、醇、醛等風味成分的產量，而且能夠提高白酒的出酒效率[7]。

迄今為止也有較多關于高產纖維素酶菌株的報道，但大部分是從土壤和腐爛的植物葉片中篩選出來的[8-12]，而從酒醅中進行篩選高產纖維素酶菌株的研究較少[13]。本試驗擬從賒店老酒濃香型白酒酒醅中篩選出一株高產纖維素酶的菌株，對該菌株進行分離鑒定和產酶條件的優化，以便將其應用于酒糟中纖維素的降解，從而提高白酒的出酒率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：取自賒店老酒股份有限公司。

羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）：天津市致遠化學試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、柱式細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：天根生化科技有限公司。

CMC-Na培養基：CMC-Na 1.5%，KH2PO40.1%，NH4NO30.1%，瓊脂2%，酵母膏0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH為自然條件（CMC-Na液體培養基不加瓊脂）。

剛果紅纖維素固體培養基：CMC-Na 1.5%，瓊脂2%，KH2PO40.1%，NH4NO30.1%，MgSO4·7H2O 0.05%。

液體產酶培養基：CMC-Na l%，酵母膏0.02%，蛋白胨0.3%，（NH4）2SO40.2%，CaC12·2H2O0.03%，MgSO4·7H2O0.03%，KH2PO40.4%。以上培養基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DNP-9272BS-Ⅲ電熱恒溫培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；Z-211恒溫培養搖床：上海知楚儀器有限公司；LDZX-50KBS立式高壓滅菌器：上海申安醫療機械廠；HH-6數顯恒溫水浴鍋：常州方科儀器（常州）有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維素酶生產菌株的分離與初篩

將酒醅樣品溶入無菌水中，稀釋為一系列不同的稀釋度，取10-3、10-4、10-5這3個稀釋梯度，將其分別涂布于CMC-Na培養基上，每個稀釋度取100 μL涂布于3個平板，在37 ℃恒溫培養箱中培養[14]，反復分離劃線至單個菌落。

在剛果紅纖維素固體培養基上接種通過分離和篩選獲得的單個菌落，在37 ℃恒溫培養箱中培養2 d之后用剛果紅溶液（1 mg/mL）染色30 min，再采用蒸餾水清洗，最后用NaCl溶液（1 mol/L）進行30 min脫色。觀察菌落的周圍是否存在透明圈，記錄透明圈的直徑和菌落的直徑的比值，并將產纖維素酶活較佳的菌種進行保存[15-16]。

1.3.2 高產纖維素酶菌株復篩

將初步篩選得來的菌株接種到CMC-Na液體培養基中，并于搖床（37 ℃、150 r/min）中培養2 d獲得均勻的種子溶液，然后按5%的比例分別接種于產酶培養基中于搖床（37 ℃、150 r/min）中培養3 d，將發酵液以8 000 r/min離心10 min，所取上清液作為粗酶液[17]。以3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定羧甲基纖維素酶（CMC）活力和濾紙酶（filter paper activity，FPA）活力，最后根據所測酶活性值選擇高產纖維素酶菌株。

羧甲基纖維素酶酶活力的定義：在50 ℃條件下，1 mL酶液在1 min內水解底物所生成1 μg的葡萄糖所消耗的酶量為1個酶活力單位，U/mL。

葡萄糖標準曲線的繪制：取25 mL試管分別添加葡萄糖標準溶液（2 mg/mL）0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL，添加蒸餾水至2 mL，然后加入DNS試劑3 mL，于沸水中煮沸5 min，待其冷卻，再添加蒸餾水，定容至15 mL，充分搖勻，用分光光度計在波長540 nm處測量并記錄吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。葡萄糖標準曲線回歸方程為y=0.864x+0.030 8，相關系數R2=0.997 9。

CMC酶活測定：分別向4支試管中（1支空白試管，3支樣品試管），加入用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.8）所配制的1%CMC-Na溶液1.5 mL，再加入0.50 mL一定稀釋比例的粗酶液（空白管中加入蒸餾水），混勻。將4支試管于（50±0.1）℃水浴中反應30 min，然后將3 mL DNS試劑快速添加到每個試管中并充分搖勻。將4支試管同時進行5 min沸水浴加熱后取出冷卻至室溫，再添加蒸餾水至15 mL并搖動，以空白管作為對照液進行調零，檢測其波長540 nm處的OD540nm值[18]。

FPA酶活測定：分別向4支試管中（1支空白管，3支樣品管），加入1.5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH4.8）和（50±0.5）mg濾紙，然后加入稀釋一定比例的粗酶液0.50 mL（空白管加蒸餾水），使濾紙完全浸沒試管內溶液。將4支試管一并置于（50±0.1）℃水浴，反應60 min，之后立即向各試管中加入DNS試劑3.0 mL，搖勻。后續試驗操作同上[19]。

1.3.3 菌種的鑒定

形態學特征初步鑒定：對菌落形態特征、顏色、大小、革蘭氏染色等進行觀察。

生理生化試驗鑒定參照文獻[20]。

分子生物學鑒定：以總DNA為模板，利用16S rDNA的1492R和27F通用引物開展聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增實驗，得到的PCR擴增產物，經過凝膠電泳后采用凝膠成像系統觀察，再進行測序與拼接，測序結果在GenBank數據庫系統中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對后，采用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.3.4 產酶條件優化單因素試驗

分別考察不同氮源、碳源、發酵溫度、發酵時間、初始pH值等單因素對菌株產纖維素酶能力的影響。

不同碳源對菌株產酶的影響：分別以CMC-Na、麩皮、蔗糖、葡萄糖、淀粉作為液體產酶培養基單一碳源（添加量為1.5%），接種量為5%，37 ℃、150 r/min恒溫搖床培養72 h后測定酶活性[21-22]。確定最適碳源后，改變碳源添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，按上述條件測定酶活以確定碳源添加量。

不同氮源對菌株產酶的影響：分別以蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、尿素、酵母粉作為液體產酶培養基單一氮源（添加量為0.1%），接種量為5%，37 ℃、150 r/min恒溫搖床培養72 h后測定酶活性。確定最適氮源后，改變氮源添加量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，按上述條件測定酶活以確定氮源添加量。

培養時間對菌株產酶的影響：在接種量為5%的條件下，將液體產酶培養基于恒溫搖床中37 ℃、150 r/min分別培養1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后測定酶活性。

培養溫度對菌株產酶的影響：在接種量為5%的條件下，將液體產酶培養基分別置于28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃恒溫搖床中150 r/min培養72 h后測定酶活性[23]。

培養基的初始pH對菌株產酶的影響：在接種量為5%的條件下，用檸檬酸緩沖液調節液體產酶培養基的初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，37 ℃恒溫搖床中150 r/min培養72 h后測定酶活性[16]。

1.3.5 產酶條件優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，使用DesignExpert8.0.6軟件，確定3因素3水平的最佳參數進行響應面分析研究，優化產纖維素酶菌株的產酶條件。響應面試驗因素與水平編碼見表1。

表1 菌株4-2產酶條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for optimization of enzyme production conditions by strain 4-2

2 結果與分析

2.1 產纖維素酶菌株的分離與篩選

將樣品酒醅稀釋液涂布于CMC-Na培養基上培養，共分離篩選出89株菌株，進一步將菌株點種于剛果紅纖維素固體培養基上，用剛果紅溶液進行染色。測透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值（D/d），篩選得到8株D/d值較大的菌株。將篩選得到的8株菌株接種到羧甲基纖維素鈉液體培養基中，測定CMC酶活、FPA酶活。結果見表2。

表2 菌株水解圈直徑與菌落直徑比值及酶活力測定結果Table 2 Determination results of hydrolysis circle diameter to colony diameter ratio and enzyme activity of strain

由表2可知，菌株4-2酶活力最高，其CMC酶活達149.93 U/mL，FPA酶活達92.90 U/mL。

2.2 菌株4-2的形態學鑒定及生理生化試驗

在37 ℃條件下，將菌株4-2于CMC培養基中培育1 d后，觀察菌株的菌落形態，結果表明，菌株的菌落顏色為乳白色，表面濕潤、不透明，菌落為規則的圓形或者橢圓形。顯微鏡下觀察的革蘭氏染色結果為紫色，菌株形態為短桿狀，說明菌株4-2為革蘭氏陽性菌。菌株4-2的生理生化試驗結果見表3。

表3 菌株4-2生理生化試驗結果Table 3 Results of physiological and biochemical experiments of strain 4-2

由表3可知，菌株4-2可水解淀粉、V.P試驗、明膠液化、硝酸鹽還原均為陽性，而吲哚試驗、硫化氫試驗均為陰性。

2.3 菌株4-2的分子生物學鑒定

菌株4-2的系統進化樹如圖1所示。由圖1可知，菌株4-2與Bacillus tequilensis相似性達100%。結合菌株4-2的生理生化結果、菌落形態特征及16S rDNA分析，鑒定菌株4-2為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）。

圖1 基于16S rDNA基因序列菌株4-2的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain 4-2 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 不同條件對菌株4-2產酶的影響

2.4.1 不同碳源對菌株4-2產酶的影響

由圖2可知，液體產酶培養基碳源為淀粉時，CMC酶活力最高，為2 028.01 U/mL，由此確定，淀粉為該菌株產酶的最佳碳源。由圖3可知，在淀粉添加量為3%時，該菌株發酵產酶能力最好，CMC酶活達2 403.78 U/mL，FPA酶活達2 234.65 U/mL。由此確定，該菌株產酶的最佳培養基碳源添加量為3%。

圖2 不同碳源對菌株4-2產酶活力影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the activity of enzyme produced by strain 4-2

圖3 淀粉添加量對菌株4-2產酶活力影響Fig.3 Effect of starch addition on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.4.2 不同氮源對菌株4-2產酶的影響

由圖4可知，液體產酶培養基氮源為酵母粉時，CMC酶活最高，為195.83 U/mL，由此確定，酵母粉為該菌株產酶的最佳氮源。由圖5可知，當酵母粉添加量為0.6%時，該菌株發酵產酶能力最好，CMC酶活達199.88 U/mL，FPA酶活達133.71 U/mL。由此確定，該菌株產酶的最佳培養基氮源添加量為0.6%。

圖4 不同氮源對菌株4-2產酶活力影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the activity of enzyme produced by strain 4-2

圖5 酵母粉添加量對菌株4-2產酶活力影響Fig.5 Effect of yeast powder addition on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.4.3 不同培養溫度對菌株4-2產酶的影響

由圖6可知，培養溫度為34 ℃時，菌株4-2發酵產酶能力最好，CMC酶活達115.59 U/mL，FPA酶活達111.73 U/mL。由此確定，該菌株產酶的最佳培養溫度為34 ℃。

圖6 不同培養溫度對菌株4-2產酶活力影響Fig.6 Effect of different temperature on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.4.4 不同初始pH對菌株4-2產酶的影響

由圖7可知，在初始pH值=5時，菌株4-2發酵產酶能力最好，CMC酶活達206.64 U/mL，FPA酶活達120.22 U/mL。由此確定，該菌株產酶的培養基最佳初始pH值為5。

圖7 不同初始pH值對菌株4-2產酶活力影響Fig.7 Effect of different initial pH value on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.4.5 不同培養時間對菌株4-2產酶的影響

由圖8可知，菌株4-2在培養5 d的時候，發酵產酶能力最好，CMC酶活達223.61 U/mL，FPA酶活達108.64 U/mL。由此確定，該菌株產酶的最佳培養時間為5 d。

圖8 不同培養時間對菌株4-2產酶活力影響Fig.8 Effect of culture time on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.5 產酶條件優化響應面試驗

2.5.1 響應面設計、回歸模型的建立及其顯著性檢驗

由表4、表5可知，回歸模型F值為489.14，且顯著性檢驗為極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.892 7＞0.05），說明該模型可靠。根據試驗結果表5對各因素試驗結果的影響進行二次擬合，經回歸擬合，得回歸方程：

回歸方程決定系數（R2）=99.84%，表明該模型可以解釋99.84%的酶活變化，非常適合實際的情況。該方程式提供了適用于菌株4-2產纖維素酶的模型，因此該模型可用于代替實際試驗點，以進行數據分析和纖維素酶生產能力的預測。

表4 菌株4-2產酶條件優化響應面試驗設計與結果Table 4 Design and results of response surface experiments for optimization of enzyme production conditions by strain 4-2

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

2.5.2 各因素交互作用的響應面圖

采用Design-Expert 8.0.6軟件得到二次響應面回歸模型，并分析和創建相應的響應面。利用回歸模型繪制的響應面及等高線見圖9。對獲得的回歸擬合方程中的三個變量分別求一階偏導數，組成方程組求解。所得結果即為最大酶活力時菌株4-2所需最佳發酵條件，為A=3.53，B=0.59，C=5.75。根據實際操作條件即得最佳發酵條件為：淀粉添加量為3.5%，酵母粉添加量為0.6%，初始pH為5.8，在此優化條件下，理論上預測的CMC最大酶活為3 058.15 U/mL，重復驗證試驗的CMC酶活實際值為3 101.83 U/mL，是優化前的20.69倍?；旧吓c預測值接近，說明所構建的模型具有良好且穩定的擬合性能。

圖9 淀粉添加量、酵母粉添加量與初始pH值交互作用對菌株4-2產酶活力影響的響應曲面與等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between starch addition,yeast powder addition and initial pH on the activity of enzyme produced by strain 4-2

3 結論

本研究通過剛果紅染色測透明圈法初篩和DNS法復篩，從賒店老酒酒醅中篩選出1株產纖維素酶能力高的菌株4-2，通過形態學觀察和分子生物學鑒定，確定該菌株為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）。通過單因素和響應面試驗確定該菌株產纖維素酶的最優條件為液體產酶培養基，淀粉添加量3.5%，酵母粉添加量0.6%，初始pH 5.8，培養時間5 d，培養溫度34 ℃。在此優化條件下，該菌株產纖維素酶活力達3 101.83 U/mL，是優化前的20.69倍。