基于高通量測序技術分析腐乳自然發酵過程微生物多樣性

石黎琳，牟方婷，李 安，張惟廣*

（西南大學 食品科學學院，重慶 400715）

發酵是世界上一種最古老的食品保存技術之一。腐乳作為傳統發酵食品，以其獨特的風味特色在我國飲食文化中占據了一席重要地位。在腐乳發酵過程中，微生物分泌產生的蛋白酶、脂肪酶和糖化酶等多種酶能夠將大豆中的蛋白質、脂肪和淀粉等大分子物質分解為游離氨基酸、脂肪酸、單糖和低聚糖等這些人體所必需且更易被吸收的小分子物質[1]，因此與未發酵的大豆相比，腐乳大大提高了大豆蛋白的生物效價，且含有豐富的維生素B12、核黃素、大豆異黃酮等生物活性物質[2]。

腐乳按其色澤、風味可分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳、醬腐乳等；根據菌種類型可分為毛霉腐乳、根霉腐乳、細菌腐乳及無菌腐乳等。盡管目前腐乳已有工業化的生產方式，但仍有很多地方的商戶采取自然發酵的方式生產腐乳來售賣。這種家庭式作坊生產的腐乳在開放的環境中進行自然發酵，其發酵過程不受控制，導致了產品的多樣性和質量的不穩定性，值得引起重視。

目前大部分的研究都是基于改善腐乳的加工工藝或對風味的影響[3-4]，對腐乳微生物多樣性尤其是在發酵過程中微生物群落變化的研究較少。如今高通量測序技術已發展成為研究微生物多樣性的有力工具，許多研究都利用該技術來進行微生物多樣性的分析，如豆豉[5]、豆醬[6]、酸湯[7]、腐乳[8-9]等，因此利用該技術對自然發酵過程中的腐乳進行微生物群落變化的研究是很有必要的，可以使我們更全面的了解腐乳中細菌和真菌群落在不同發酵階段的變化，了解其在各個發酵階段的優勢菌屬，為改善腐乳的發酵工藝來保障其產品質量提供可靠的科學依據，對指導腐乳的生產具有實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

腐乳樣品：采購于重慶市北碚區菜市場，根據當地采用的發酵工藝結合腐乳發酵的變化選擇在三個階段進行取樣。采樣第一階段：豆腐開始有長菌絲的趨勢時；采樣第二階段：豆腐表面生長菌絲完全時；采樣第三階段：菌絲倒完的成品腐乳；采樣過程中均使用無菌采樣袋進行采樣。樣品的第一階段編號為A1，第二階段編號為A2，第三階段編號為A3。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國MP Biomedicals生物醫學公司；瓊脂糖凝膠：西班牙BIOWEST公司；凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA抽提

采用DNA提取試劑盒對腐乳樣品中微生物的基因組DNA進行抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增

按指定測序區域，合成帶有barcode的特異性引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）、907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）、ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。為保證后續數據分析的準確性及可靠性，需滿足兩個條件：（1）盡可能使用低循環數擴增；（2）保證每個樣本擴增的循環數一致。隨機選取具有代表性的樣本進行預實驗，確保在最低循環數中使絕大多數樣本能夠擴增出濃度合適的產物。每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR擴增產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴增產物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。

PCR擴增體系：5×FastPfu Buffer 5 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）2.5 μL，5 μmol/L正向引物1 μL，5 μmol/L反向引物1 μL，FastPfu DNA聚合酶0.5 μL，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）0.25 μL，DNA模板10 ng，補充雙蒸水（ddH2O）至20 μL。

細菌PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min，27次循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸5 min。

真菌PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min，32次循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸5 min。

1.3.3 熒光定量

參照電泳初步定量結果，將PCR擴增產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.3.4 Illumina PE250文庫構建

連接“Y”字形接頭；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴增進行文庫模板的富集；氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

1.3.5 Illumina PE250測序

DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋（bridge）”；PCR擴增，產生DNA簇；DNA擴增子線性化成為單鏈；加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，每次循環只合成一個堿基；用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3'端粘性，繼續聚合第二個核苷酸；統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA片段的序列。

1.3.6 測序數據分析

Illumina PE250測序得到的PE reads首先根據Overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，根據PE reads之間的Overlap關系，將成對的Reads拼接成一條序列；最后按照Barcode和引物序列拆分得到每個樣本的優質序列，并在過程中根據正反Barcode和引物方向校正序列方向以及去除嵌合體，用Usearch軟件和gold數據庫，采用Donovo和Reference結合的方式去除嵌合體。區分樣本后進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析和物種分類學分析，細菌16S rDNA基因序列基于Silva[10]數據庫，真菌5.8 ITS基因序列基于Unite[11]數據庫，用Usearch對OTU進行聚類分析，基于OTU聚類分析結果，對OTU進行Alpha多樣性指數分析，以及對測序深度的檢測，用Mothur[12]做Rarefaction分析，利用R語言工具作稀釋性曲線圖；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統計分析并用R語言工具作圖。

2 結果與分析

2.1 稀釋性曲線

稀釋性曲線[13]采用對樣本序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建稀釋性曲線，它可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU。腐乳樣品細菌及真菌稀釋性曲線見圖1。由圖1可知，曲線最終的趨勢都趨于平坦，說明此次測序數據合理，測序深度能反映樣品中的物種信息。

圖1 細菌（a）及真菌（b）稀釋性曲線Fig.1 Dilution curve of bacteria (a) and fungi (b)

2.2 Alpha多樣性分析

通過樣本的多樣性分析（Alpha多樣性）可以反映微生物群落的豐度和多樣性，Chao指數是用Chao1算法估計樣本中所含OTU數目的指數，Chao指數和ACE指數可以用來代表菌群的豐度。辛普森（Simpson）指數與香農（Shannon）指數都是用來估算樣本中微生物多樣性的指數，Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低，Shannon指數值越大，說明群落多樣性越高。Coverage是指各樣本文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，該指數反映測序結果是否代表了樣本中微生物的真實情況。腐乳樣品細菌Alpha多樣性指數見表1，真菌Alpha多樣性指數見表2。由表1及表2可知，所有樣本的測序Coverage指數均＞0.999，說明腐乳樣品中序列基本都被測出，未被測到的概率較低，本次測序結果可以反映樣品真實情況。由Chao指數和ACE指數可以看出無論是細菌還是真菌，在發酵的第三階段菌群豐度是最高的，其中隨著發酵時間的推移，細菌的菌群豐度變化不大，而真菌的菌群豐度有較明顯的變化。由Simpson指數和Shannon指數可以看出，在發酵的第二階段，細菌和真菌的群落多樣性是最低的，而細菌群落多樣性最高是在發酵的第一階段，真菌群落多樣性最高是在發酵的第三階段。

表1 腐乳樣品中細菌Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of bacteria in sufu samples

表2 腐乳樣品中真菌Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity index of fungal in sufu samples

2.3 微生物群落的OTU分布

用韋恩（Venn）圖來表示樣本中所共有和獨有的OTU數目，可以比較直觀的表現樣本的OTU數目組成相似性及重疊情況，腐乳樣品中細菌及真菌群落的OUT分布Venn圖見圖2。由圖2可知，第一階段的細菌OTU數是78個，第二階段的細菌OTU數是79個，第三階段的細菌OTU數是84個，三個樣本中共有的OTU數是56個，說明在三個發酵階段中細菌組成大部分相似。由圖2亦可知，第一階段的真菌OTU數是31個，第二階段的真菌OTU數是11個，第三階段的真菌OTU數是96個，三個樣本中共有的OTU數是6個，說明在三個發酵階段中真菌組成相似性不高。

圖2 細菌（a）及真菌（b）群落OTU分布Venn圖Fig.2 Venn diagram of OTU distribution of bacterial (a) and fungal (b)community

2.4 微生物群落結構分布

使用統計學的分析方法分析測序結果，并用柱狀圖的形式展現出來，可以用來觀測樣本在不同分類水平上的群落結構分布[14]，并將多個樣本的群落結構進行對比，可以更直觀的感受到腐乳在發酵過程中微生物群落結構的變化。

2.4.1 細菌群落多樣性

基于門和屬水平，各個發酵階段腐乳樣品中細菌群落結構的分布情況見圖3，發酵完成后，腐乳樣品中細菌在域、門、綱、目、科、屬等分類學水平上的物種比例和分布見圖4。

圖3 基于門（a）及屬（b）水平細菌群落結構分布Fig.3 Distribution of bacteria community structure at the phylum (a)and genus (b) level

由圖3可知，在細菌門水平上，樣本中主要存在的是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）這三類，在發酵的第一階段，樣品的細菌群落組成以變形菌門（61%）為主，第二階段擬桿菌門（49%）和變形菌門（43%）分別占有較大比例，而第三階段占比較多的則是厚壁菌門（50%）和變形菌門（45%）。由圖3及圖4可知，在樣本中共鑒定出16個屬和其他未被鑒定出的腸桿菌科，在發酵的第一階段相對豐度含量較高的依次是不動桿菌屬（Acinetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、類香味菌屬（Myroides）和叢毛單胞菌屬（Comamonas）。第二階段占比較大的菌屬是類香味菌屬（Myroides），其次是叢毛單胞菌屬（Comamonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。第三階段的占比較大的菌屬則有乳球菌屬（Lactococcus）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、漫游球菌屬（Vagococcus）。可以看到隨著發酵時間的推移不動桿菌屬的數量越來越少；類香味菌屬在發酵中期占很大比例，而在發酵完成后的含量卻很低；假單胞菌屬在發酵完成后含量顯著低于前兩個階段；乳球菌屬、未被鑒定出的腸桿菌科和果膠桿菌屬都是呈現先減少后增加的趨勢；叢毛單胞菌屬則呈現出先增加后減少的趨勢。

圖4 腐乳發酵第三階段細菌多級物種組成圖Fig.4 Bacterial multistage species composition at the third

不動桿菌屬[15]廣泛分布于自然界、水體和土壤中，醫院環境與健康人的皮膚、呼吸道、消化道也會存在，目前對不動桿菌屬的研究大部分集中在鮑曼不動桿菌耐藥性方面。GUO X等[16]從豆豉這類發酵大豆食品中分離出了可以降解亞硝酸鹽的不動桿菌屬類細菌，劉亞棟[17]用16S rDNA基因序列分析的方法鑒定腐乳的微生物多樣性時發現了不動桿菌屬。類香味菌屬[18]不分解糖類，脲酶陽性，可以還原亞硝酸鹽，臨床上類香味菌屬細菌感染非常少見，大部分菌株對青霉素、頭孢菌素、氨基糖苷類等藥物耐藥，其在發酵食品中出現的作用機理目前尚不明確。假單胞菌屬可以分解蛋白質，所以在富含蛋白質的肉類、豆類等食品中常以假單胞菌屬這類腐敗菌為優勢菌屬，因此假單胞菌屬大量存在于發酵前兩個階段中來分解豆制品中的蛋白質[19]。乳球菌屬主要從乳制品、植物產品中分離出，發酵完成后的樣品中存在的乳球菌屬是棉子糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），棉子糖乳球菌具有產γ-氨基丁酸的能力[20]，γ-氨基丁酸是一種生理活性物質，這賦予了腐乳較好的生理活性功能，并且曾承露等[21]還初步證實了棉子糖乳球菌具有抑制金黃色葡萄球菌這類致病菌生成的作用，這對腐乳的衛生安全也是有益的。乳酸乳球菌是同型發酵細菌，廣泛應用于發酵乳制品的制作，能夠將牛乳中的蛋白質或脂肪降解成特定的風味物質或前體。腸桿菌科因其分布范圍廣，寄主范圍大，因此與人類關系密切，腸桿菌科里的很多菌屬都是食物中常見的并能夠引起細菌性感染的致病菌。果膠桿菌屬里存在的菌種是胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種（Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense），馮志琴等[22]研究發現，這種細菌能夠侵染十字花科、茄科、菠菜、芹菜和大多數葫蘆科作物，引起其軟腐病，所以推測這種細菌在發酵完成后的樣品中增加可能是因為商家將發酵完成的腐乳包在白菜里而侵染了這種細菌。叢毛單胞菌屬目前多用于生物降解的研究，在降解環境污染物方面有較好作用[23]，劉亞棟[17]也在腐乳中發現過叢毛單胞菌屬。明串珠菌屬[24]是泡菜、干酪等發酵食品中的優勢菌群，研究發現明串珠菌屬的某些細菌有抑菌作用，對一些常見致病菌如金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌等有較好的拮抗作用，在腐乳、豆醬、泡菜中都分離出了明串珠菌屬，明串珠菌屬還應用到了酵素食品的加工中[25]。漫游球菌屬[26]是一類可感染動物的細菌，關于漫游球菌屬在發酵食品中的報道也很少見，其中河流漫游球菌可作為益生菌應用，而水獺漫游球菌可對人類健康產生影響。

2.4.2 真菌群落多樣性

基于門和屬水平，各個發酵階段腐乳樣品中真菌群落結構的分布情況見圖5，發酵完成后，腐乳樣品中真菌在域、門、綱、目、科、屬等分類學水平上的物種比例和分布見圖6。

圖5 基于門（a）及屬（b）水平真菌群落結構分布Fig.5 Distribution of fungi community structure at the phylum (a) and genus (b) level

由圖5可知，在整個發酵過程中，真菌群落的組成相對細菌來說較簡單，在發酵第三階段的樣本中，真菌群落的種類相對前兩個階段顯著增加。在真菌門水平上，主要存在的是子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），發酵完成后子囊菌門占絕大優勢。

由圖5及圖6可知，在樣本中共鑒定出12個真菌屬，其中大部分都是在第三階段才出現在樣本中。在發酵的第一階段和第二階段，占比較大的真菌菌屬為久浩酵母屬（Guehomyces）和假絲酵母屬（Candida），而在發酵的第三階段這兩種菌屬都降至很低，說明在發酵前期起主導作用的是酵母菌，酵母菌不僅對形成產品的風味物質有貢獻，還可以抑制有害菌的生長，有的酵母菌的代謝產物還有利于乳酸菌的生長[27]。此外，鏈格孢屬（Alternaria）、赤霉菌屬（Gibberella）、枝孢屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）在發酵前期幾乎不存在，發酵完成后大量出現，其中鏈格孢屬和赤霉菌屬占比最大，說明從發酵開始到發酵結束，真菌群落結構分布有著顯著的變化。久浩酵母屬在鲊廣椒、酸湯子面團等發酵食品中都有被檢測到[28-29]，應該是一類參與食品發酵的重要菌屬，但在腐乳中沒有被報道過。假絲酵母屬[30]有的菌種具有酒精發酵能力，可通過發酵作用增加產品的醇香，有的菌種能利用農副產品或碳氫化合物生產蛋白質，有的菌種則會引起感染而致病，假絲酵母屬因其優良的生物特性常被用于食品工業、制藥業和化妝品業[31]。鏈格孢屬[32]在自然界分布廣泛，一些鏈格孢屬產生的真菌毒素能夠引發多種農作物的病害，在一些瓜果蔬菜、酒水飲品、食用油里均檢測到過鏈格孢毒素。赤霉菌屬主要寄生于植物體內，是一類在農業生產上具有破壞性的植物病原真菌，推測其出現可能是由于在發酵完成后接觸了其他物質而導致。王暉等[33]也曾在腐乳中檢測到過枝孢屬和曲霉屬。

圖6 腐乳發酵第三階段真菌多級物種組成圖Fig.6 Fungi multistage species composition at the third stage of sufu fermentationstage of sufu fermentation

3 結論

腐乳的自然發酵與微生物的作用密切相關，本研究利用高通量測序技術，對腐乳自然發酵過程中的微生物多樣性進行分析，結果表明，發酵的第一階段，占比較大的細菌門為變形菌門，真菌門為擔子菌門，細菌屬為不動桿菌屬、乳球菌屬、假單胞菌屬，真菌屬為久浩酵母屬、假絲酵母屬；發酵的第二階段，占比較大的細菌門為擬桿菌門，真菌門為擔子菌門，細菌屬為類香味菌屬、叢毛單胞菌屬、假單胞菌屬，真菌屬為久浩酵母屬、假絲酵母屬；發酵的第三階段，占比較大的細菌門為厚壁菌門，真菌門為子囊菌門，細菌屬為乳球菌屬、果膠桿菌屬，真菌屬為鏈格孢屬、赤霉菌屬。不同階段中主要存在的菌屬不同，在腐乳整個發酵過程中既出現了有益于發酵的菌屬，也有會影響產品質量的菌屬。