吡嗪類化合物抗幽門螺桿菌活性及機制研究

常韶娜，羅 強，劉 杰，劉志剛*

（深圳大學 醫學部，廣東 深圳 518000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是唯一能棲息于人胃內的微生物，而Hp感染是誘發消化性潰瘍、胃癌等的重要原因之一[1-2]。在中國，Hp感染的患病率很高（約60%），而Hp對抗生素的高耐藥率導致抗生素和質子泵抑制劑對其治療效果不佳[3]。

受傳統習俗和文化的影響，在中國，飲酒是一種普遍行為。據2002年全國營養與健康調查結果顯示，我國15歲以上居民男性飲酒比例為39.6%，女性為4.5%[4]。文獻報道，白酒中富含生物活性成分，如醬香型白酒中已鑒定的生物活性成分有500多種[5]。研究表明，乙醇攝入與Hp感染具有一定的關系，而白酒含有的生物活性成分是否具有抑制Hp感染作用的相關報道很少[6]，川芎嗪又稱四甲基吡嗪，在醬香型白酒中廣泛分布，主要具有殺菌抗癌、抗炎、改變微循環、制止血栓形成等功效[7-8]。而研究顯示醬香型白酒中含有的風味物質中，吡嗪類化合物（pyrazines，PYRs）占有極大的比例[5]。因此，本實驗利用反轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）分析PYRs對Hp基因及相關毒力蛋白表達的影響，檢測PYRs預處理Hp對胃黏膜上皮細胞（GES-1）活性、細胞凋亡的影響，對吡嗪類物質抗Hp活性及減輕Hp對胃黏膜上皮細胞的損傷活性進行研究，旨在揭示吡嗪類化合物抗幽門螺桿菌活性及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SydneyStrain 1（SS1）幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）標準菌株：深圳大學醫學院病原微生物系惠贈。胃上皮GES-1細胞株：美國ATCC公司；胎牛血清（fetalbovine serum，FBS）：美國Hyclone公司；青-鏈霉素、RPMI 1640培養基：美國Hy-Clone公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）：廣州瑞舒生物科技有限公司；一氧化氮（NO）、前列腺素（prostaglandin，PG）E2、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）1β、白細胞介素-6（IL-6）、細胞計數試劑盒（cellcountingkit，CCK）-8、酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等試劑盒：四正柏生物科技有限公司；Cag A和VacA抗體：美國Santa Cruz Biotechnology公司；哥倫比亞瓊脂、布氏肉湯培養基：英國Oxoid公司。醬香型白酒（Moutai-flavourliquor，MTL）：市售。醬香型白酒中生物活性成分（醬香型白酒中含有的非乙醇類化合物的總稱）（BMC）、醬香型白酒中吡嗪類化合物（PYRs）：阿拉丁試劑有限公司[5]。

1.2 儀器與設備

三菱C-31厭氧培養盒：日本三菱集團；DHP系列恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；ACB-4A1型超凈化工作臺：上海實驗儀器廠；SW-CJ-IC型超凈工作臺：蘇州安泰科技有限公司；INC108型CO2培養箱：德國Memmert公司；TECAN infinite M200型多功能酶標儀：瑞士Tecan Trading AG公司；2K15型低溫高速離心機：美國Sigma公司；CFX96型PCR儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 PYRs細胞毒性檢測

胃上皮GES-1細胞接種于96孔板中（5 000 cells/孔），分別加入質量濃度為3.12 mg/mL、0.625 mg/mL、0.125 mg/mL、0.025 mg/mL、0.005 mg/mL、0.001 mg/mL 的BMC、MLT 及PYRs溶液，培養24 h、48 h，CCK-8法檢測細胞活力。

1.3.2 體外抑菌實驗

將凍存的Hp復蘇，接種于哥倫比亞瓊脂固體培養基，置于37 ℃微需氧環境（體積分數為5%的O2，體積分數為10%的CO2，體積分數為85%的N2）中培養。72 h后轉至布氏肉湯液體培養基，置于37 ℃微需氧環境，在100 r/min的搖床上振蕩，擴大培養。取用Hp時，將培養3 d的Hp菌株挑起一部分，用無菌生理鹽水洗下后，配成布氏肉湯菌懸液，再用標準比濁管比濁，校正菌液濃度，使其菌液濃度相當于1×108CFU/mL[9]。

在37 ℃微需氧條件下培養72 h后PYRs對Hp的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）進行檢測[10]。

1.3.3 RT-PCR檢測Hp毒力基因表達的變化

溶解BMC、MTL及PYR-19（2,5-二甲基-3-正戊基吡嗪）于PBS至終質量濃度為0.125 mg/mL；將培養的Hp菌液用PBS重懸至1×107CFU/mL，取含0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BMC、MTL及PYRs溶液中，37 ℃振蕩微氧孵育72 h，離心棄上清，用PBS沖洗3次后，使用核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）prep pure Cell/BMCteria Kit（TianGen公司，中國）分離總RNA。互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleicacid，cDNA）的合成按試劑盒（SYBR@Prime ScriptTMRT-PCRKit）操作說明進行。引物如表1所示。

表1 幽門螺桿菌毒力基因（Cag A、Vac A和Bab A）的引物序列Table 1 Primer sequences of virulence genes (Cag A, Vac A and Bab A) of Helicobacter pylori

1.3.4 Western blotting檢測

用PBS作為溶劑溶解BMC、MTL及PYR-19至終濃度為0.125 mg/mL。將培養的Hp菌液用PBS重懸至1×107CFU/mL，取含0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BMC、MTL及PYR-19溶液中，37 ℃振蕩微氧孵育72 h，離心棄上清，用PBS沖洗3次后，按細菌蛋白提取試劑盒（Solarbio公司，中國）說明提取細菌總蛋白，Western blotting檢測細胞毒素A（Cag A）和空泡毒素A（Vac A）的蛋白表達情況[11]。

1.3.5 細胞活性及凋亡的檢測

用PBS作為溶劑溶解BMC、MTL及PYR-19至終濃度為0.125 mg/mL。將培養的Hp菌液用PBS重懸至1×107CFU/mL，取含0.1 mL Hp的PBS混懸液加入配制好的BMC、MTL及PYR-19溶液中，37 ℃振蕩搖菌24 h。收集細菌，PBS洗2次，調節細菌終濃度為1×107CFU/mL。1×105cells/mL胃上皮GES-1細胞鋪于6孔板中培養24h。設置空白對照組（Control）；Hp損傷組（Hp）；加入BMC處理的Hp為BMC組（BMC）；加入MTL處理的Hp為MTL組（MTL）；加入PYR-19處理的Hp為PYR-19組（PYR-19）；使Hp與GES-1細胞比例為100∶1，GES-1細胞與Hp培養24 h后，收集細胞，PBS洗滌。

CCK-8試劑盒法檢測GES-1細胞活性；收集包括上清液漂浮在內的全部細胞，1 000 r/min離心5 min，用預冷的PBS洗2次，按Annexin V-FITC/PI試劑盒使用說明流式細胞術檢測細胞凋亡情況；ELISA試劑盒檢測細胞中NO、PGE2、TNF-α、IL-1β及IL-6含量；Western blotting檢測GES-1細胞i-NOS、COX-2的表達變化。

1.3.6 數據處理

所有數據采用GraphPad Prism 8軟件進行統計。P＜0.05定為具有顯著性差異，結果均以Mean±SEM表示；對樣本先進行方差齊性檢驗，方差齊時，用One-Way ANOVA檢驗，并進行組間的多重比較；方差不齊時，用非參數秩和檢驗，先用Kruskal-WallisHtest 比較總的差異，再用Mann-Whitney U 進行兩組之間比較。

2 結果與分析

2.1 BMC對GES-1細胞的毒性作用

為避免BMC及PYRs對GES-1細胞的細胞毒性，采用CCK-8法檢測了BMC、MTL及PYRs對GES-1細胞活性的影響。實驗結果顯示，與空白對照組（Control）相比，當BMC、MTL及PYRs質量濃度低于0.125 mg/mL時，細胞活性均無顯著性差異（24，48 h，P＞0.05），說明GES-1細胞未受到顯著的損傷。

2.2 BMC抑制Hp增殖

由表2可知，BMC、MTL及PYRs具有一定的抑菌活性。其中，BMC、MTL、PYRs的抑菌90%細菌生長的最低濃度（90%minimal inhibitory concentration，MIC90）為592.7 μg/mL、655.9 μg/mL、（182.5～426.1）μg/mL，雖遠高于阿莫西林及紅霉素，但仍說明BMC、MTL及PYRs具有一定的抗Hp活性。吡嗪類化合物中，PYR-19（2,5-二甲基-3-正戊基吡嗪）抑制Hp增殖活性最強，其MIC90為182.5 μg/mL。

表2 吡嗪類化合物、生物活性成分和醬香型白酒體外抑菌活性Table 2 In vitro antibacterial activity of pyrazines,bioactive components and Moutai-flavour liquor

PYR-19的抗Hp活性結果如圖1所示。由圖1可知，隨著PYR-19質量濃度的增大及作用時間的延長，Hp的增殖能力被顯著抑制。因此說明PYR-19對Hp的增殖抑制具有時間和劑量依賴性。

圖1 吡嗪類化合物-19質量濃度（A）和作用時間（B）對抑制幽門螺桿菌增殖能力的影響Fig.1 Effect of pyrazines-19 mass concentration (A) and reaction time(B) on inhibiting Helicobacter pylori proliferation

2.3 PYR-19降低Hp損傷GES-1細胞能力

PYR-19對Hp損傷GES-1細胞能力的影響結果如圖2所示。由圖2可知，與空白對照組相比，Hp組中細胞活力下降16.9%（P＜0.05），說明Hp感染會損傷GES-1細胞，使細胞活力降低；PYR-19、BMC及MTL組中細胞活力比Hp組分別高8.48%（P＜0.05）、6.81%（P＜0.05）、3.85%，說明BMC、MTL及PYR-19處理Hp能夠降低其對GES-1細胞的損傷能力。

圖2 BMC、MTL、吡嗪類化合物-19對幽門螺桿菌損傷GES-1細胞能力的影響Fig.2 Effect of BMC,MTL and pyrazines-19 on the ability of Helicobacter pylori to damage GES-1 cells

PYR-19抑制Hp誘導GES-1細胞凋亡能力結果如圖3所示。由圖3可知，與空白對照組（2.96±0.31）%相比，Hp組中GES-1細胞總凋亡率增加18.4%（P＜0.05），說明Hp感染會損傷GES-1細胞進而導致細胞凋亡增加。而PYR-19、BMC及MTL組中GES-1細胞凋亡率比Hp低11.6%（P＜0.05）、10.4%（P＜0.05）、4.80%（P＜0.05），說明BMC、PYR-19及MTL能夠顯著降低Hp對GES-1細胞的損傷，使Hp誘導的GES-1細胞凋亡被抑制。

圖3 BMC、MTL、吡嗪類化合物-19對幽門螺桿菌誘導GES-1細胞凋亡能力的影響Fig.3 Effect of BMC,MTL and pyrazines-19 on GES-1 cells apoptosis induced by Helicobacter pylori

2.4 PYR-19抑制Hp對GES-1細胞的炎性損傷能力

研究報道，Hp感染會損傷胃黏膜細胞，誘發炎性細胞因子分泌[12]。而炎性細胞因子（如IL-1β、TNF-α和IL-6）的分泌與病毒、細菌及環境刺激因子暴露有著密切的關系。過量的炎性細胞因子分泌與誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）介導的NO生成與Hp感染誘發的胃腸道上皮細胞損傷具有密切的關系[13]。因此采用ELISA試劑盒檢測方法檢測培養基中炎性細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的含量以評價PYR-19抑制Hp對GES-1細胞的損傷能力。

由圖4A～圖4C可知，與空白對照組相比，Hp顯著誘導GES-1細胞IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌，使GES-1細胞IL-6、TNF-α和IL-1β分泌增加832%（P＜0.05）、1 730%（P＜0.01）及801%（P＜0.01）；誘發細胞炎癥反應，使炎性細胞因子分泌顯著增加。BMC預處理后，與Hp組相比，IL-6、TNF-α和IL-1β分泌減少41.4%（P＜0.05），60.7%（P＜0.05），42.5%（P＜0.05）；PYR-19預處理后，與Hp組相比，IL-6、TNF-α和IL-1β分泌減少45.1%（P＜0.05），62.6%（P＜0.05），46.7%（P＜0.05）；說明PYR-19能夠抑制Hp對GES-1細胞的炎性損傷能力。類似的，MTL處理對Hp顯著誘導GES-1細胞IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌也有一定的抑制作用，但抑制能力低于PYR-19及BMC。

圖4 BMC、MTL、吡嗪類化合物-19對幽門螺桿菌抑制GES-1細胞炎癥細胞因子分泌及蛋白表達的影響Fig.4 Effect of BMC,MTL and pyrazines-19 on inhibiting inflammatory cytokines secretion and protein expression of GES-1 cells by Helicobacter pylori

炎癥是由多種分子機制介導的復雜過程，其中包括誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）這兩個重要分子以及它們所生成的一氧化氮（NO）和前列腺素E2（prostaglandin2，PGE2）的參與[14-15]。由圖4D可知，Hp顯著誘導了GES-1細胞NO和PGE2分泌。與Control組比，Hp組NO和PGE2分泌別增加983%（P＜0.01）及782%（P＜0.01）。與Hp組相比，BMC組NO和PGE2分泌減少50.2%（P＜0.05）、42.5%（P＜0.05）；PYR-19組NO和PGE2分泌分別減少60.8%（P＜0.05）、64.9%（P＜0.05）；說明BMC、PYR-19預處理可降低Hp對GES-1細胞的炎癥損傷能力。類似的（圖4E，F），與Hp顯著誘導GES-1細胞iNOS、COX-2表達不同，BMC、PRY-19顯著抑制了Hp對GES-1細胞誘導iNOS、COX-2表達能力。MTL處理對Hp顯著誘導Hp對GES-1細胞誘導iNOS、COX-2表達也有一定的抑制作用，但抑制能力低于PYR-19及BMC。

2.5 PYR-19抑制Hp毒力基因及蛋白的表達

Bab A是Hp外膜蛋白基因，Bab A蛋白可特異性結合宿主細胞受體，賦予Hp持久定植能力[16]；高毒力的Hp菌株多具有細胞毒素相關基因（Cag A），Cag A蛋白可參與轉運及宿主炎癥反應[17]；空泡細胞毒素A（Vac A）能夠破壞宿主細胞內吞作用、抑制免疫細胞導致免疫耐受和慢性感染等[18]。通過檢測Hp Bab A、Cag A及Vac A基因轉錄及蛋白表達以評價BMC預處理對抑制作用。

RT-PCR檢測PYR-19預處理對Hp膜蛋白基因Bab A、細胞毒素基因A（Cag A）和空泡毒素基因A（Vac A）基因轉錄的影響，結果如圖5A所示，BMC、MTL及PYR-19預處理能夠抑制Hp中Bab A、Cag A及Vac A的轉錄。其中，PYR-19及BMC預處理對Bab A、Cag A及Vac A基因的抑制作用高于MTL組。相比于Hp未處理組，PYR-19預處理后，Bab A、Cag A及Vac A基因轉錄下降73.2%（P＜0.01）、48.3%（P＜0.05）、73.8%（P＜0.01）；而BMC組，Bab A、Cag A及Vac A基因表達下降66.7%（P＜0.05）、30.8%（P＜0.05）、65.8%（P＜0.05）。因此推測BMC、PYR-19預處理可通過抑制HpBab A、Cag A及Vac A基因的轉錄，進一步抑制Bab A、Cag A及Vac A編碼蛋白表達，從而抑制Hp對宿主細胞的黏附，減少其誘發炎癥反應導致的宿主細胞損傷，減少Hp對GSE-1細胞的損傷能力[19-20]。

Western Blotting進一步分析PYR-19預處理對Hp Cag A和Vac A蛋白表達的影響，結果如圖5B所示。與RT-PCR結果（圖5A）類似，BMC、PYR-19預處理能夠顯著降低Hp中Cag A和Vac A的表達。說明BMC、PYR-19預處理可通過抑制Hp中相關毒力基因的轉錄及表達發揮抑制Hp對GES-1細胞的損傷活性。

圖5 吡嗪類化合物-19抑制幽門螺桿菌毒力基因轉錄及毒力蛋白表達Fig.5 Pyrazines-19 inhibiting virulence gene transcription of virulence protein expression of Helicobacter pylori

3 結論

研究發現Hp感染會損傷GES-1細胞，誘導GES-1細胞凋亡；Hp 感染GES-1 細胞會誘發細胞炎性細胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）分泌。此外，Hp感染也會誘導GES-1細胞NO、PGE2分泌，過量細胞炎性細胞因子分泌會進一步損傷GES-1細胞，使細胞凋亡增加。PYR-19處理Hp后，GES-1細胞炎性細胞因子及NO、PGE2分泌顯著減少，iNOS、COX-2表達減少，說明BMC、PYR-19處理抑制了Hp誘導GES-1細胞炎性損傷的能力。

在Hp感染小鼠的動物模型中，Cag A、Vac A陽性Hp菌株感染的胃黏膜炎癥反應更顯著，凋亡細胞數更多，提示Cag A、Vac A的表達對Hp損傷宿主細胞具有重要的作用。本實驗發現醬香型白酒中的生物活性物質及吡嗪類物質可抑制Hp相關毒力基因Bab A、Vac A和Cag A的轉錄及Vac A、Cag A蛋白的表達，從而降低Hp誘導GES-1細胞炎性因子分泌，進而減少GES-1細胞凋亡。