miR-28-5p對結腸癌細胞增殖和遷移的影響*

朱庭沛，桂裕昌，覃慧晴，陳建泉，唐云，許建文

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院 康復醫學科，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫藥大學 第一臨床醫學院，廣西 南寧 530021）

結腸癌（colon cancer）是一種常見的消化道惡性腫瘤，據我國2018 年癌癥統計報告顯示，相較2015 年，結腸癌的發病率已由第五位上升至第三位，死亡率仍維持在第五位［1］。我國已成為全球結腸癌每年新發病例和死亡病例數最多的國家。結腸癌的發病率逐年顯著上升，且多數病人在確診時已屬于中晚期。目前針對結腸癌的治療手段以外科手術結合放化療為主，雖有一定治療成效，但腫瘤的復發和遠處轉移嚴重影響患者的生存率［2］。因此，探尋結腸癌的發病機制，提高結腸癌早期診斷率，尋找新的治療靶點迫在眉睫。

微小RNA（miRNA）是一類由19～23 個核苷酸組成的內源性單鏈非編碼RNA，它通過堿基互補配對方式與靶基因的3'非翻譯區（3'-UTR）互補位點特異性結合，從而在轉錄后水平對靶基因的表達進行調控［3］。研究表明，miRNA 在不同條件下是一把雙刃劍，既可以作為癌基因致病，也可以作為抑癌基因對機體起到保護作用［4-5］。miRNA 對腫瘤的發生發展起著重要的影響，包括維持增殖信號、逃逸生長抑制因子、抵抗細胞死亡、激活侵襲和轉移以及誘導血管生成等［6］。近年各項研究發現，miR-28-5p 在食管癌、乳腺癌、淋巴瘤與膠質瘤中均有抑癌作用［7-10］，但有關miR-28-5p 對結腸癌生物學作用的影響尚少見報道。本研究旨在探討miR-28-5p 對結腸癌細胞增殖和遷移能力的影響，為結腸癌的臨床防治提供新的研究方向和選擇。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人正常結腸細胞NCM460 以及人結腸癌細胞株HCT116、SW480、SW620 均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，胎牛血清購自依科賽生物科技（太倉）有限公司，RMPI-1640培養基購自美國Gibco 公司，lipofectamine 3000 購自美國Invitrogen 公司，miR-28-5p 過表達與沉默siRNA （miR-28-5p mimic and miR-28-5p inhibitor）由韓國Bioneer 公司合成，CCK 盒購自美國Abmole 公司，NucleoZOL 試劑盒購自德國MACHEREY-NAGEL 公司，逆轉錄試劑盒（638313）、實時熒光定量試劑盒（RR820A）及相關引物均購自日本Takara 公司，其余細胞培養材料均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，37℃細胞培養箱購自美國賽默飛世爾科技公司，倒置顯微鏡購自尼康映像儀器銷售（中國）有限公司，NanoDropTMOne 超微量核酸蛋白濃度測定儀購自美國賽默飛世爾科技公司，QuantStudioTM5 全功能定量PCR 儀購自美國Applied Biosystems 公司，酶標儀購自德國Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 NCM460、HCT116、SW480、SW620 細胞均置于37℃，5%CO2培養箱中，使用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素混合液的RPMI-1640 培養基進行培養。將HCT116、SW480、SW620 三種細胞株各分為三組：對照組、過表達組、沉默組，其中對照組不予特殊處理，過表達組、沉默組取對數生長期細胞分別轉染miR-28-5p mimic 和miR-28-5p inhibitor，轉染步驟依據lipofectamine 3000 試劑盒說明書進行，并根據轉染效率優化方案。

1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應 使用NucleoZOL試劑盒提取各組細胞總RNA，NanoDropTMOne 檢測總RNA 濃度，逆轉錄試劑盒合成cDNA（37℃1 h，85℃5 min），PCR 反應體系與反應條件依據試劑盒說明書設置。基因的相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。U6 作為內參，引物序列詳見表1。

表1 PCR 引物序列

1.2.3 CCK8 法檢測細胞增殖 將轉染后的各組細胞接種于96 孔板中，每孔加入100 μL 細胞懸液（1×104個細胞），每組設置5 個復孔，置于37℃培養箱中分別培養12 h、24 h、48 h。隨后去除原有培養基，每孔加入90 μL 完全培養基和10 μL CCK8 試劑（確保無氣泡生成），37℃環境下孵育1 h 后，使用酶標儀檢測450 nm 處的光密度（OD）值。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移 將轉染后的各組細胞接種于6 孔板中，待細胞鋪滿6 孔板底部后，每孔用無菌10 μL 槍頭輕劃三條垂直豎線，用常溫無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗三次，隨后加入2 mL 完全培養基，分別于0 h、48 h 顯微鏡下拍照，使用ImageJ 軟件分析劃痕面積，計算劃痕遷移率=（0 h 面積-48 h 面積）/0 h 面積。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-28-5p 在不同結腸癌細胞中的表達差異

培養NCM460、HCT116、SW480 和SW620 細胞，采用qRT-PCR 檢測miR-28-5p 在各細胞中的相對表達量，結果顯示，miR-28-5p 在結腸癌細胞HCT116、SW480 和SW620 中的相對表達量均低于正常結腸細胞NCM460，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-28-5p 在不同細胞中的相對表達量

2.2 miR-28-5p 對結腸癌細胞增殖的影響

將HCT116、SW480 和SW620 三種細胞各分為三組：對照組、過表達組、沉默組。對照組不予處理，過表達組和沉默組分別轉染miR-28-5p mimic 和miR-28-5p inhibitor，采用qRT-PCR 檢測miR-28-5p 在各組細胞中的相對表達量，結果顯示，與對照組相比，miR-28-5p 在過表達組中的相對表達量均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），在沉默組中的相對表達量均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），證明轉染成功。見圖2。

圖2 miR-28-5p 在不同轉染后結腸癌細胞中的相對表達量

2.3 miR-28-5p 對結腸癌細胞遷移的影響

劃痕實驗結果顯示，相較于對照組，HCT116、SW480 和SW620 三種結腸癌細胞中過表達組細胞的遷移能力均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），沉默組細胞的遷移能力均增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 miR-28-5p 對結腸癌細胞增殖的影響

CCK8 檢測結果顯示，12 h 時，三種結腸癌細胞中各組細胞間OD 值差異無統計學意義（P＞0.05）。24 h、48 h 時，相較于對照組，三種結腸癌細胞中過表達組細胞的OD 值均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），表明其增殖能力下降；沉默組細胞的OD 值均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），表明其增殖能力增強。見表3。

表2 各組細胞劃痕遷移率比較 （,%）

表2 各組細胞劃痕遷移率比較 （,%）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

表3 各組細胞增殖能力檢測結果比較 （）

表3 各組細胞增殖能力檢測結果比較 （）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

3 討論

結腸癌是女性第二大常見癌癥和男性第三大常見癌癥，約占全球每年新確診癌癥總數的10%。因其發病較隱匿，早期臨床癥狀常以腹脹等不典型癥狀為主，以至于患者未引起重視，導致早期確診困難，約有50%的患者在就診時已發生結腸癌的遠處轉移［11］，錯過了最佳的治療時機，據統計結腸癌的全球死亡率高達40%以上［12-13］。雖然結腸癌的手術方式，放化療手段日益進展，但此類患者術后的五年存活率仍不足65%［14］。因此，早期確診結腸癌至關重要。隨著腫瘤生物學的發展，相關科研人員與臨床醫生都迫切希望從基因或分子層面探究結腸癌的病因與發生機制，尋找結腸癌早期診斷的靶標，從而使患者獲益。

人們對miRNA 認識的不斷深入，其對腫瘤的調控作用逐漸成為研究熱點［15］，基于miRNA 與結腸癌相關性的研究也越來越多。2017 年，FENG等［16］發現過表達的miR-590-3P 可以促進結腸癌細胞的惡性增殖。隨后ZHU 等［17］的研究結果顯示，miR-873-5p 可以通過抑制TUSC3/AKT 通路抑制結腸癌細胞的生長。2019 年，DEHGHAN 等［18］最新研究表明miR-21 可作為早期結腸癌的診斷標記物，尤其是男性結腸癌。諸多相關研究均提示miRNA 與結腸癌的發生發展有著密不可分的聯系，但有關miR-28-5p 在結腸癌中的作用研究還少見報道。

miR-28-5p 作為miRNA 家族中的一員，在腎癌、卵巢癌和前列腺癌中均可發揮抑癌作用［19-21］，與此同時，miR-28-5p 在消化系統腫瘤中的作用也不斷被研究證實。HAN 等［22］研究表明，過表達的miR-28-5p 會促進胰腺癌的發展。XIAO 等［23］發現，miR-28-5p 可以通過抑制AKT 磷酸化從而抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。近期有研究結果顯示［24］，miR-28-5p 可以通過IGF-1 途徑調節肝癌干細胞的增殖。在本研究首先通過qRT-PCR 實驗證實了miR-28-5p 在HCT116、SW480、SW620 三類結腸癌細胞株中的表達量均顯著低于正常結腸細胞，提示miR-28-5p 可能參與結腸癌發展的相關調控。隨后通過siRNA 轉染技術沉默和過表達HCT116、SW480、SW620 三類結腸癌細胞中miR-28-5p 的表達水平，再通過CCK8 實驗和劃痕實驗發現，在三類miR-28-5p 過表達的結腸癌細胞中，細胞增殖能力和遷移能力均降低，而在三類miR-28-5p 沉默的結腸癌細胞中，細胞增殖能力和遷移能力均增強。

綜上所述，本研究初步探討了miR-28-5p 對結腸癌細胞的生物學影響，結果提示miR-28-5p 具有調控結腸癌細胞增殖和遷移的作用，從而參與結腸癌的發生、發展及轉移。未來我們將進一步深入探討其作用機制。miR-28-5p 有望成為結腸癌新的生物標志物和治療靶點，為結腸癌的防治提供新的思路。