用于有機(jī)磷農(nóng)藥及其水解產(chǎn)物可視化檢測的熒光探針制備及性質(zhì)研究

王 彥，余 海，王利杰，袁歡歡，石道飛

（安慶師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，光電磁功能材料安徽省重點(diǎn)實(shí)驗室，安徽安慶246133）

農(nóng)藥包括多種有機(jī)毒性化合物，對昆蟲、細(xì)菌、野草、線蟲等危害農(nóng)作物的物種具有防御作用，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。其中有機(jī)磷農(nóng)藥的使用最為廣泛，這造成了有機(jī)磷農(nóng)藥在水資源、土壤以及農(nóng)作物中的蓄積與殘留，危害環(huán)境安全以及人體健康[1-5]。美國環(huán)境保護(hù)局對各種有機(jī)磷農(nóng)藥在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量作了嚴(yán)格的規(guī)定，即最高殘留限量（MRL）。農(nóng)藥的高毒性源于它可以抑制乙酰膽堿酯酶的活性，某些農(nóng)藥即使很小的劑量，也會對健康造成極大的危害。因此發(fā)展新型的、高靈敏的、經(jīng)濟(jì)的環(huán)境以及農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留的傳感技術(shù)對于保護(hù)人類健康以及環(huán)境安全具有重要的意義。毒死蜱（chlorpyrifos，CP）是一種廣譜性有機(jī)磷殺蟲劑，是目前世界應(yīng)用廣泛的殺蟲劑之一。2013年農(nóng)業(yè)部發(fā)出公告，對毒死蜱和三唑磷等7種農(nóng)藥采取進(jìn)一步禁限用管理措施，控制其在蔬菜中的使用。因此，需設(shè)計針對毒死蜱的靈敏檢測方法。

目前已有多種方法被用于農(nóng)藥的檢測，例如氣、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[5-8]，電化學(xué)分析[9]，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗[10-13]等，但是這些方法存在操作繁瑣、數(shù)據(jù)重復(fù)性差、設(shè)備不便攜等缺點(diǎn)，無法滿足實(shí)時在線檢測的需求。貴金屬納米材料具有表面等離子激元共振效應(yīng)，可以用于量子點(diǎn)多色光致發(fā)光、表面增強(qiáng)拉曼等領(lǐng)域的研究。將納米材料的獨(dú)特光學(xué)特性與熒光傳感方法高靈敏度、高選擇性的優(yōu)勢相結(jié)合，可以構(gòu)筑一系列具有優(yōu)越性能的熒光傳感器，從而實(shí)現(xiàn)對不同分析物的實(shí)時、靈敏、可視化在線檢測[14-20]。以貴金屬納米材料構(gòu)筑傳感器件的納米探針，為有機(jī)磷農(nóng)藥殘留分析提供了新的手段[21-22]。因此，本文報道基于金納米顆粒的熒光探針的設(shè)計方法，以用于環(huán)境樣品中農(nóng)藥殘留的可視化檢測。

1 實(shí)驗部分

藥品及儀器。實(shí)驗用化學(xué)藥品有氯金酸溶液、檸檬酸三鈉、羅丹明B、二乙氧基硫代磷酰氯（阿拉丁試劑及藥品），乙腈、氯仿、氫氧化鈉和鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。實(shí)驗所用化學(xué)試劑均為分析純，且未作任何處理，蒸餾水自制。測試儀器有HitachiF-4500型熒光分光光度計（日本日立公司）、透射電子顯微鏡（TEM）（日本電子公司）。

金納米顆粒的制備。本實(shí)驗首先采用檸檬酸鈉還原法制備金納米粒子。將50 mL氯金酸溶液（1 mM）移入裝有回流冷凝管的圓底燒瓶中加熱至沸騰，在強(qiáng)力攪拌下快速注入38.8 mM檸檬酸三鈉5 mL，繼續(xù)回流30 min。溶液顏色由淺黃色變成深紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌冷卻至室溫。放到冰箱4℃保存、備用。

金納米顆粒的修飾。利用超純水制備2 mM的羅丹明B溶液。取10μL羅丹明B溶液攪拌加入10 mL濃度為15 nM的金納米顆粒中。混合溶液在室溫下攪拌兩小時，反應(yīng)完全后收集溶液，并測其熒光光譜。

毒死蜱堿性水解產(chǎn)物二乙氧基硫代磷酸的制備。在單口燒瓶中加入體積比為1.25∶1的乙腈和水，并在磁力攪拌下使其混合均勻。然后在混合液中加入2 mL的二乙氧基硫代磷酰氯和1.6 g氫氧化鈉，摩爾比約為3∶1。在30°C的條件下攪拌12 h，然后利用鹽酸將反應(yīng)液調(diào)至弱酸性，并用氯仿萃取，收集有機(jī)相，旋蒸后得到產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米顆粒的透射電鏡（TEM）表征

用透射電鏡觀察金納米顆粒的形貌，其結(jié)果如圖1所示。由圖可見，金納米顆粒是單分散的，平均粒徑為13.3 nm。金納米顆粒的濃度是通過監(jiān)測520 nm的吸收（摩爾吸光系數(shù)為K=108 M-1·cm-1）來計算得到，利用朗伯比爾定律計算為15 nM。

圖1 金納米顆粒的透射電鏡圖

圖2 金納米顆粒吸收擬合曲線

2.2 檢測體系的設(shè)計原理與信號響應(yīng)

探針的設(shè)計基于兩個必要條件：（1）羅丹明B與金納米顆粒之間有熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的通道[23-24]，通過目標(biāo)分子的加入以調(diào)節(jié)能量轉(zhuǎn)移通道的開關(guān)；（2）農(nóng)藥分子與金納米顆粒表面的非共價作用力強(qiáng)于羅丹明B，將羅丹明B分子從金納米顆粒表面置換下來。探針的設(shè)計如圖3所示。

圖3 熒光增強(qiáng)型探針的識別原理

首先確定羅丹明B與金納米顆粒之間可以發(fā)生FRET，由圖4（a）中可以看出，金納米顆粒在520 nm左右有明顯的特征吸收，羅丹明B在580 nm左右有特征熒光發(fā)射峰，金納米顆粒的吸收與羅丹明B的熒光發(fā)射存在一定程度的光譜重疊，滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生的條件。因此，當(dāng)羅丹明B非共價吸附在金納米顆粒表面時，由于能量轉(zhuǎn)移，羅丹明B的熒光被淬滅。

由圖4（b）可以看出，當(dāng)沒有加入DEP時，羅丹明B-金納米顆粒（RhB-AuNPs）的熒光強(qiáng)度較低，當(dāng)向探針中加入1μM的DEP時，體系的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)兩倍多，同時伴隨著探針溶液熒光強(qiáng)度的可視化變化。在體系中沒有DEP時，在365 nm紫外燈的激發(fā)下，探針溶液呈現(xiàn)十分微弱的橙色熒光，引入DEP到探針溶液中顯示明亮的橙色熒光，從光譜圖與照片中可以看出羅丹明B的特征熒光發(fā)射峰恢復(fù)。這是因為毒死蜱在堿性條件下可以發(fā)生水解反應(yīng)生成硫代二乙氧基磷酸（diethylphosphorothioate，DEP）和三氯吡啶酚（3,5,6-trichloro-2-pyridinol，TCP）［結(jié)構(gòu)如圖4（c）所示］，毒死蜱及其堿性水解產(chǎn)物硫代二乙氧基磷酸均含有磷硫鍵，磷硫鍵與金表面有很強(qiáng)的配位能力，強(qiáng)于羅丹明B在金表面的吸附能力，從而能夠取代吸附在金表面的羅丹明B分子。由于發(fā)生配位取代后，羅丹明B從金納米顆粒表面脫附，無法滿足FRET發(fā)生的條件，從而使羅丹明B的熒光恢復(fù)。因此探針RhB-AuNPs可以靈敏地識別DEP。

圖4 （a）金納米顆粒的吸收譜、羅丹明B的發(fā)射光譜、RhB-AuNPs的熒光光譜；（b）加入1μM DEP前后RhB-AuNPs的熒光光譜及實(shí)物照片；（c）毒死蜱在堿性條件下水解生成硫代二乙氧基磷酸和三氯吡啶酚

2.3 熒光檢測毒死蜱及其堿性水解產(chǎn)物

以上實(shí)驗結(jié)果表明，DEP可以調(diào)節(jié)羅丹明B與金納米顆粒之間的能量轉(zhuǎn)移。圖5顯示CP與DEP均能使體系的熒光增強(qiáng)，相比之下，DEP使熒光增強(qiáng)的趨勢更明顯。當(dāng)DEP加入到RhB-AuNPs體系中時，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在低至0.1 nM的DEP濃度時，仍然能夠檢測到明顯的熒光增強(qiáng)，說明探針對DEP有很好的靈敏度。當(dāng)DEP的濃度達(dá)到1mM時，體系的熒光強(qiáng)度變化趨勢平緩，相較于加入DEP之前，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了4倍左右，如圖5（b）所示。熒光增強(qiáng)過程是非線性的，存在一個飽和的DEP濃度，表明吸附在金納米顆粒表面的DEP與羅丹明B有一個動態(tài)平衡的過程。CP堿性水解形成的DEP不僅具有P=S鍵，還帶有離域的S=P=O鍵，配位能力更強(qiáng)，因此取代作用更明顯，引起的熒光強(qiáng)度變化更大，這和已報道的探針特性相吻合[25-27]。

圖5 納比探針RhB-AuNPs熒光強(qiáng)度的變化。（a）不同濃度的CP；（b）不同濃度的DEP

對熒光強(qiáng)度和底物濃度作Stern-Volmer曲線，如圖6所示，發(fā)現(xiàn)其變化趨勢明顯向上彎曲，不是線性的，表明增強(qiáng)的過程是通過靜態(tài)途徑或靜態(tài)、動態(tài)相結(jié)合的途徑進(jìn)行的，在這種情況下，應(yīng)用非線性Stern-Volmer方程，I0/I=Aek[Q]+B，其中A、B和k是常數(shù)(Ksv=A×k)，根據(jù)公式DL=3σ/M（σ為標(biāo)準(zhǔn)差，M為斜率），CP的Ksv=5.24×105M-1，檢出限為2.3×10-11M；而DEP的Ksv=1.031×106M-1，檢出限為1.16×10-11M[27]。

圖6 (I0/I)-1與CP濃度（a）、DEP濃度（b）和KSV的非線性Stern-Volmer圖

3 結(jié)論

利用金屬納米顆粒和熒光分子的能量轉(zhuǎn)移原理，本課題組設(shè)計了基于金納米顆粒的熒光探針實(shí)驗方案。實(shí)驗中設(shè)計制備非共價修飾羅丹明B的金納米顆粒，并從熒光共振能量轉(zhuǎn)移的信號響應(yīng)原理出發(fā)，結(jié)合羅丹明B與農(nóng)藥分子在金納米顆粒表面的競爭吸附作用，發(fā)展了熒光增強(qiáng)型的靈敏檢測農(nóng)藥殘留的傳感方法。當(dāng)農(nóng)藥分子存在時，體系熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)4倍左右的增強(qiáng)，并伴隨由微弱熒光-強(qiáng)橙色熒光的靈敏可視化變化。該方法不需要為了實(shí)現(xiàn)FRET過程在納米材料表面進(jìn)行復(fù)雜繁瑣的表面修飾過程，簡單易行，在環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測方面具有一定的應(yīng)用前景。