中國優勢基因型弓形蟲Wh3株誘導人單核巨噬細胞THP-1偏移極化的研究

張芳芳，王 聰，羅慶禮，沈繼龍

剛地弓形蟲（toxoplasma gondii，T.gondii）是一種全球廣泛傳播的機會致病性原蟲，專性寄生在有核細胞內，引起人畜共患寄生蟲病。世界各地分離的弓形蟲株基因型具有豐富的遺傳多態性和地域差異，流行于歐洲和北美的主要有Ⅰ型（ToxoDB＃10）、Ⅱ型（ToxoDB＃1）和Ⅲ型（ToxoDB＃2）三種基因型，均包含多個蟲株；流行于中國的弓形蟲株優勢基因型為 Chinese 1型（ToxoDB＃9），其中的 TgCtWh3株（以下簡稱Wh3株），毒力介于強毒的RH株（屬于Ⅰ型）和弱毒的ME49株（屬于Ⅱ型）之間，且同時具有Ⅰ型蟲株的棒狀體蛋白激酶ROP16和Ⅱ型蟲株的致密顆粒蛋白GRA15。ROP16驅動巨噬細胞極化為旁路途徑活化的巨噬細胞（M2）；而GRA15誘導巨噬細胞極化為經典途徑活化的巨噬細胞（M1）。雖然 Wh3株同時具有 ROP16和GRA15，但其感染人巨噬細胞后，誘導其分化偏移M1或M2，至今鮮有報道。該文采用Wh3株、RH株和ME49株分別感染人單核巨噬細胞THP-1，了解Wh3株感染后巨噬細胞的分化偏移情況，為深入探討中國優勢基因型弓形蟲株致病性和免疫性，具有重要的理論和實際意義。

1 材料與方法

1.1 弓形蟲株和細胞株 弓形蟲Wh3株、RH株由病原生物學安徽省重點實驗室液氮保種，復蘇、腹腔接種5～6周齡昆明小鼠傳代；ME49株由含包囊的小鼠腦組織，無菌勻漿經口灌胃保種、傳代。人單核巨噬細胞THP-1，購自中國科學院上海細胞庫，病原生物學安徽省重點實驗室液氮保種、傳代。

1.2 主要試劑 FBS（加拿大 Wistent公司）；DMEM培養基、BCA試劑盒、RIPA細胞裂解液（上海碧云天公司）；PMA（美國 Sigma公司）；TRIzol（美國Invitrogen公司）；硝酸纖維膜（美國 Billerica公司）；兔抗人Arginase-1、兔抗人iNOS抗體和山羊抗兔IgG H＆L（HRP）（美國Abcam公司）、內參小鼠抗人β-actin和山羊抗小鼠IgG酶標記抗體（武漢Proteintech公司）；引物合成（上海生工生物公司）；白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factors，TNF）-α和 TGF-βELISA檢測試劑盒（武漢華美公司）。

1.3 弓形蟲W h3株和RH株的獲取 分別取出液氮中凍存保種的弓形蟲Wh3株速殖子和RH株速殖子，迅速置于37℃水浴中，緩慢搖動至融化。凍存管內加入等量無菌生理鹽水以稀釋乙二醇的毒性，輕輕吹打混勻，調整濃度為1×10個／ml速殖子。

1.4 弓形蟲ME49株的獲取 麻醉處死用于保種的感染ME49小鼠，制備腦組織勻漿，顯微鏡下計數包囊數，調整包囊濃度，部分予小鼠灌胃繼續保種；取約200個包囊，進行昆明小鼠腹腔接種，7～10 d后小鼠出現活動減少、弓背、豎毛和明顯腹水時，無菌收集小鼠腹腔液，用27 G針頭注射器反復抽吸裂解細胞，釋放細胞內的速殖子；腹腔液1 350 r／min離心10 min，收集弓形蟲，加適量PBS洗1次，即可獲得ME49速殖子；用含10%FBS的RPMI 1640培養基調整速殖子濃度備用。

1.5 THP-1細胞系培養與刺激 THP-1細胞在含10%FBS RPMI 1640的完全培養基中，37℃、5% CO培養，細胞呈懸浮狀態生長。實驗前給予200 ng／ml PMA刺激作用24 h，誘導THP-1分化成人巨噬細胞，并促使細胞貼壁生長；用無菌PBS輕輕洗滌3次，更換不含PMA的新鮮培養基培養過夜，用于后續分別感染不同蟲株的弓形蟲。

1.6 RH-Mφ、W h3-Mφ和ME49-Mφ的獲取 設6 h和24 h兩大組：每組均包含 Control組，即人THP-1對照組；RH組，即用 RH株速殖子感染人THP-1組（RH-Mφ）；Wh3組，即用 Wh3株速殖子感染 THP-1組（Wh3-Mφ）；ME49組，即用 ME49株速殖子感染人THP-1組（ME49-Mφ）。上述THP-1細胞置12孔板中培養，PMA刺激分化并貼壁生長后，加入不同蟲株的弓形蟲。弓形蟲與巨噬細胞比例為2∶1，6 h組細胞培養至6 h后，24 h組細胞培養至24 h后，分別離心，收集細胞培養上清液，-80℃冷凍保存，備用；收集沉淀，分別為未感染THP-1細胞、RH-Mφ細胞、Wh3-Mφ細胞和ME49-Mφ細胞，加入PBS重懸細胞進行清洗，4℃、4 000 r／min離心10 min，棄上清液，沉淀細胞置-80℃冷凍保存，備用。

1.7 培養上清液細胞因子檢測 采用ELISA法分別檢測6 h和24 h收集的THP-1細胞、RH-Mφ細胞、Wh3-Mφ細胞和ME49-Mφ細胞培養上清液中IL-6、IL-10、TNF-α和 TGF-β濃度。

1.8 熒光定量PCR分析M 1／M 2相關基因轉錄水平 上述培養的每組巨噬細胞收集后，離心棄去培養基，加入PBS重懸細胞進行洗滌，4℃、4 000 r／min離心10 min，吸除上清液，將所得巨噬細胞置冰上，每管加入TRIzol 1 ml，反復吹打裂解細胞，提取細胞總RNA。按照試劑盒操作說明，將RNA反轉錄制備出cDNA，-20℃保存備用。以β-actin為內參進行熒光定量PCR反應，條件如下：預變性94℃，5 min；變性94℃，1 min；退火56℃，1 min；延伸72℃，1 min；4℃保存。擴增引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.9 Western blot測定 iNOS、Arginase-1表達水平 按照說明書，將上述收集凍存的各組細胞，按照每孔150μl的體積加入細胞裂解液，反復吹打后冰浴10 min，4℃、12 000 r／min離心5 min，所得上清液即細胞總蛋白溶液。BCA法測各組蛋白濃度，根據蛋白濃度進行上加樣，電泳、轉膜、封閉，加入iNOS（1∶1 000）、Arginase-1（1∶1 000）和 β-actin（1∶5 000）抗體，4℃低速振蕩孵育過夜后，室溫下TBS-T洗滌3次，每次10 min，隨即加入相應二抗（1∶1 500），室溫孵育1 h，再次 TBS-T洗滌。加入化學發光試劑后，拍照分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 培養上清液巨噬細胞M 1極化細胞因子表達情況 上述各組細胞感染3株弓形蟲速殖子培養6、24 h后，培養上清液經ELISA檢測，結果見圖1。在培養6 h后，IL-6表達量3蟲株感染組均高于Control組（5.62±1.16）pg／ml，四組間差異有統計學意義（F＝701.7，P＜0.000 1），且三感染組中ME49組表達量（103.95±3.07）pg／ml最高，Wh3組（35.29±4.15）pg／ml居中，RH組（20.74±2.06）pg／ml最少，組間差異均有統計學意義（P＜0.01）；TNF-α表達量 ME49組（15.81±0.71）pg／ml高于其他各組，四組間差異有統計學意義（F＝10.45，P＜0.005），其他組之間差異無統計學意義；在培養24 h后，IL-6表達量 ME49組（262.59±41.44）pg／ml和 Wh3組（119.56±16.48）pg／ml均高于 RH組（28.85±11.67）pg／ml和 Control組（11.24±2.09）pg／ml，四組間差異有統計學意義（F＝61.95，P＜0.000 1），且 ME49組表達量高于 Wh3組（P＜0.01），RH組和Control組間差異無統計學意義；TNF-α表達量 ME49組（17.34±1.13）pg／ml和 Wh3組（13.86±0.11）pg／ml均高于 RH組（12.07±0.46）pg／ml和 Control組（10.78±0.65）pg／ml，四組間差異有統計學意義（F＝50.30，P＜0.000 1），且 ME49組表達量高于 Wh3組（P＜0.001），RH組和Control組間差異無統計學意義。

圖1 培養上清液巨噬細胞M 1極化細胞因子ELISA檢測結果

2.2 培養上清液巨噬細胞M 2極化細胞因子表達情況 圖2顯示在培養6 h后，IL-10表達量在三個感染組中均高于 Control組（4.84±4.12）pg／ml，四組間差異有統計學意義（F＝18.49，P＜0.001），且三組中 RH組表達量（21.70±3.43）pg／ml最高，Wh3組（14.53±1.56）pg／ml居中，ME49組（5.28±2.95）pg／ml最低，除了 ME49組與 Control組比較差異無統計學意義外，其他組間差異均有統計學意義（P＜0.01）；TGF-β表達量 RH組（1 216.67±546.73）pg／ml高于其他各組 （F＝4.811，P＜0.01），其他組之間差異無統計學意義。在培養24 h后，IL-10表達量同樣是RH組（24.43±2.41）pg／ml最高，Wh3組（18.64±1.71）pg／ml居中，ME49組（9.80±3.66）pg／ml最低 （F＝22.19，P＜0.001），組間差異均有統計學意義（P＜0.05），三組中ME49組與Control組差異無統計學意義；TGF-β表達量 RH組（2 136.90±707.94）pg／ml和 Wh3組（1 856.63±602.36）pg／ml高于其他兩組，四組間差異有統計學意義（F＝8.139，P＜0.001），而 RH組和Wh3組之間以及ME49組和Control組之間差異無統計學意義。

圖2 培養上清液巨噬細胞M 2極化細胞因子ELISA檢測結果

2.3 巨噬細胞M 1相關基因轉錄水平 上述各組細胞培養6、24 h后，M1相關基因mRNA轉錄水平見圖3。培養6 h后，iNOS的mRNA轉錄水平RH組（2.29±0.17）均高于其余三組，四組間差異有統計學意義（F＝55.20，P＜0.000 1），Wh3組（1.25±0.08）、ME49組（1.30±0.08）和 Control組（1.03±0.17）之間差異無統計學意義；培養24 h后，Wh3組（1.92±0.13）和 ME49組（2.27±0.44）均高于 RH組（1.35±0.15）和 Control組（1.05±0.12），四組間差異有統計學意義（F＝14.68，P＜0.01），且 Wh3組和ME49組差異無統計學意義，RH組和Control組差異也無統計學意義。培養6 h后，TNF-α和IL-12的mRNA轉錄水平ME49組［（11.95±1.419）、（5.73±0.39）］均高于其余三組，四組間差異有統計學意義（F＝183.5，P＜0.000 1；F＝234.7，P＜0.000 1），RH組、Wh3組和Control組之間差異無統計學意義；培養24 h后，TNF-α在三個感染組均高于Control組，四組間差異有統計學意義（F＝7.484，P＜0.05），且三個感染組組間差異無統計學意義；IL-12的mRNA轉錄水平在Wh3組（4.30±0.56）和ME49組（17.28±1.06）均高于 RH組（1.81±0.71）和 Control組（1.04±0.13），四組間差異有統計學意義（F＝348.9，P＜0.000 1），且ME49組高于Wh3組（P＜0.000 1），RH組和 Control組差異無統計學意義。

圖3 巨噬細胞M 1相關基因轉錄水平

2.4 巨噬細胞M 2相關基因轉錄水平 圖4所示各組細胞培養6、24 h后，M2相關基因mRNA轉錄水平。培養6、24 h后，Arginase-1的mRNA轉錄水平 RH組［（2.14±0.06）、（2.50±0.38）］均高于其余三組，差異有統計學意義（F＝55.20，P＜0.000 1；F＝18.83，P＜0.001），Wh3組、ME49組和Control組之間差異無統計學意義。在培養6、24 h后，三個感染組TGF-β的mRNA轉錄水平均高于Control組，差異有統計學意義（F＝34.13，P＜0.000 1；F＝8.792，P＜0.01），且培養6 h后 RH組（2.60±0.25）高于 Wh3組（2.18±0.24）和 ME49組（1.84±0.08），差異有統計學意義（P＜0.05），Wh3組和ME49組之間差異無統計學意義；而培養24 h后三個感染組間差異均無統計學意義。IL-10的mRNA轉錄水平在培養6 h后，RH組（4.37±0.46）和 Wh3組（2.35±0.50）均高于 Control組（1.01±0.16），ME49組（0.31±0.20）低于 Control組，各組間差異均有統計學意義（F＝72.14，P＜0.001）；在培養24 h后三個感染組均高于Control組（F＝57.92，P＜0.000 1），且三組中 RH組（3.37±0.07）最高，Wh3組（2.38±0.33）次之，ME49組（1.60±0.27）最低，各組間差異有統計學意義（P＜0.001）。

圖4 巨噬細胞M 2相關基因轉錄水平

2.5 巨噬細胞iNOS和Arginase-1表達水平 上述各組細胞培養6、24 h后，Western blot檢測iNOS和Arginase-1蛋白表達結果見圖5。培養6 h后，各組均未檢測到iNOS蛋白表達；在培養24 h后，Control組和RH組同樣未檢測到iNOS蛋白表達，Wh3組（0.351±0.057）和ME49組（0.427±0.014）可見iNOS蛋白表達，四組間差異有統計學意義（F＝127.8，P＜0.000 1），而有 iNOS表達的 Wh3組和ME49組間差異無統計學意義。Arginase-1在培養6 h后，RH組（0.681±0.041）和 Control組（0.721±0.039）表達量差異無統計學意義，而Wh3組（0.568±0.047）和ME49組（0.333±0.024）表達量降低，差異有統計學意義（F＝61.53，P＜0.000 1），且ME49組更低（P＜0.001）；24 h后，RH組表達量（0.595±0.015）較 Control組（0.435±0.047）升高（P＜0.001），ME49組（0.186±0.012）較 Control組降低（P＜0.000 1），Wh3組（0.412±0.023）與 Control組差異無統計學意義，各組間差異有統計學意義（F＝109.1，P＜0.001）。

圖5 巨噬細胞iNOS、Arginase-1表達水平

3 討論

巨噬細胞作為抵御病原體感染的第一道防線，在機體固有免疫和適應性免疫應答中發揮重要作用。研究表明巨噬細胞具有很多種類，表型和功能受周圍微環境的調節，其通常存在于兩個不同的亞群：具有促炎性的典型途徑活化的巨噬細胞（M1）和抗炎及免疫調節作用旁路途徑活化的巨噬細胞（M2）。細菌脂多糖和Th1型細胞因子（如TNF）可誘導巨噬細胞向M1表型分化；Th2型細胞因子（如IL-4）可誘導巨噬細胞向M2表型分化。弓形蟲作為有核細胞內寄生原蟲，巨噬細胞是其理想的寄生細胞。而巨噬細胞偏移或極化的狀態不同，決定了弓形蟲感染后機體的不同免疫應答反應，以及宿主感染后的預后和轉歸。

本研究選用的THP-1細胞，系人類白血病單核細胞，該細胞系目前已作為評價單核細胞和巨噬細胞活性的常用模型。懸浮生長的THP-1細胞經PMA刺激后，分化成巨噬細胞樣細胞，分化的THP-1細胞更像天然單核細胞來源的巨噬細胞。

既往的研究發現，弓形蟲毒力效應分子ROP16和 GRA15，具有絲氨酸／蘇氨酸（Ser／Thr）蛋白激酶活性，可誘導巨噬細胞向不同的方向極化，不同弓形蟲株的ROP16和GRA15分子，存在多態性，具有不同的作用。Ⅰ型RH株GRA15不具有激酶活性，而Ⅱ型蟲株（PRU、ME49）的 GRA15（GRA15）蛋白可以直接磷酸化NF-κB p65蛋白，使巨噬細胞向M1方向極化，誘導 Th1／Th17和 NK細胞活化，產生促炎細胞因子 IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和 TNF-α，高表達 iNOS和產生 NO和ROS，驅動宿主的Th1型免疫應答，在感染早期即發揮強力的細胞內殺蟲效應以控制感染，宿主獲得強力的免疫力。Ⅱ型蟲株（PRU、ME49）的 ROP16無磷酸化 STAT3／STAT6激酶活性，Ⅰ型和Ⅲ型蟲株（如 RH、CTG）ROP16（ROP16）蛋白可以磷酸化 STAT3／STAT6誘導巨噬細胞向M2方向極化，產生IL-10、TGF-β等抗炎細胞因子，高表達Arginase-1和產生大量的多巴胺，誘導宿主的Th2型免疫應答，結果使得蟲體毒力增強，不能在組織內形成包囊進入隱性感染，而在巨噬細胞內大量繁殖，導致全身播散甚至致宿主死亡。

前期的研究表明，中國優勢基因型Chinese 1 Wh3株，不同于其他的弓形蟲株，同時具有ROP16和 GRA15兩種效應分子。實驗證實，Wh3株來源的 ROP16分子可驅動巨噬細胞向M2型偏移；GRA15蛋白可使巨噬細胞向M1方向極化，并已被用于治療肝癌及血吸蟲感染所致的肝纖維化等。因此，Wh3株弓形蟲感染后，誘導巨噬細胞向哪個方向偏移，一直是我們關注的焦點。

本研究通過ELISA檢測弓形蟲RH株、Wh3株和ME49株感染巨噬細胞6、24 h后，培養上清液中細胞因子含量發現，IL-6和TNF-α在巨噬細胞感染弓形蟲ME49株后含量最高，表明ME49蟲株可誘導巨噬細胞向M1極化；RH蟲株感染后IL-10和TGF-β含量最高，表明其可誘導巨噬細胞向M2極化；而在上述ELISA檢測中發現，弓形蟲Wh3株感染后培養上清液細胞因子含量介于RH株和ME49株之間。

在細胞因子和iNOS、Arginase-1的mRNA轉錄水平檢測中發現，除iNOS在感染6 h后RH蟲株升高外，iNOS在感染24 h后，TNF-α和IL-12在感染6、24 h后，弓形蟲ME49株轉錄水平均高于Wh3株和RH株，提示ME49蟲株可誘導巨噬細胞向M1極化；RH株感染6、24 h后IL-10和Arginase-1的mRNA轉錄水平及感染6 h后TGF-β轉錄水平均高于Wh3株和ME49株，表明RH株可誘導巨噬細胞向M2極化；同樣發現弓形蟲Wh3株介于RH株和ME49株之間。

Western blot測定iNOS、Arginase-1也得到相似的結果。在Wh3株和ME49株弓形蟲感染24 h后，iNOS蛋白表達增高，提示Wh3株和ME49株弓形蟲可誘導巨噬細胞向M1方向極化；而Arginase-1在感染Wh3株和ME49株弓形蟲后表達量降低，且感染4 h后，RH株表達量升高，提示RH株弓形蟲可誘導巨噬細胞向M2方向極化。

本研究中發現，iNOS在RH蟲株感染6 h后mRNA轉錄水平升高，但各組均未檢測出iNOS蛋白表達，推測mRNA轉錄水平升高可能是因為在弓形蟲感染早期，急性炎癥反應誘導所致，與巨噬細胞的偏移或極化無關。

在Wh3株感染后，巨噬細胞表現出介于M1和M2之間的極化方向，本研究結果提示，其更接近于RH株的M2極化方向。然而，弓形蟲Wh3株感染后誘導巨噬細胞極化方向，是蟲體內的GRA15和ROP16效應分子的共同作用以及相互拮抗所致，或是還存在其他的分子共同參與作用，仍需我們進一步的探索。