白芷乙素通過抑制ERK1／2和NF-κB p65的活化緩解心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷和氧化應激

黎 明，王妹芳，吳寶珍，劉珍君，李 波，姚 峰

心肌缺血-再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI／R）損傷是冠狀動脈介入治療中常見且不可避免的問題，介入治療后對患者的生活質量有很大的影響。中國是人口大國，人口正逐漸老齡化。除腫瘤外，冠心病已成為老年人的常見病和死亡原因，發病率逐年上升。探討心肌缺血的治療和預防已變得尤為迫切和重要。除了干預來解決心臟的大血管問題外，藥物治療已成為治療冠心病的主要方法。近年來，天然化合物已經成為開發新型心臟病藥物的主要來源。

白芷乙素是一種天然產生的呋喃香豆素，可以在一些中草藥如白芷和當歸的根和果實中找到。研究表明，白芷乙素具有廣泛的藥理活性，如保護心血管、抗凋亡、抗炎、抗氧化等。據報道，白芷乙素通過增加內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表達來抑制心肌纖維化。也有研究提示，白芷乙素通過線粒體／caspase介導的信號通路抑制類風濕性關節炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖并誘導細胞凋亡。還有報道稱，白芷乙素可通過減少促炎因子，減輕氧化應激和調節腦源性神經營養因子來改善脂多糖誘導的記憶缺陷。然而，白芷乙素在MI／R損傷方面的研究，鮮有報道。該研究主要探究白芷乙素是否通過抑制ERK1／2和 NF-κB p65的活化而影響 MI／R大鼠心肌損傷和氧化應激。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）試劑盒和大鼠肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）試劑盒購自美國 Biocompare公司；10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、羊抗兔 IgG-HRP、ECL化學發光檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；抗體Bax（1∶1 000）、Actin（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、P65（1∶1 000）、p-P65（1∶1 000）、細胞外信號調節激酶1／2（extracellular signal-regulated kinase 1／2，ERK1／2）（1∶1 000）、p-ERK1／2（1∶1 000）購自美國 CST公司；抗體 Bcl-2（1μg／ml）購自美國invitrogen公司。Vevo770 ultrasound system小動物超聲儀購自加拿大Visual Sonics公司；Multiskan Sky多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；E100顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 動物來源與分組 35只SPF級的雄性SD大鼠，購自卡文斯百格（蘇州）模式動物研究有限公司。實驗動物生產許可證號 ：SCXK（蘇）2018-0002。小鼠飼養溫度18～25℃，濕度50%～70%，適應性飼養7 d。將SD大鼠隨機均分為5組（n＝7）：健康對照組（Control組），心肌缺血再灌注模型組（MI／R組），低、中、高劑量白芷乙素組（6.25、12.50、25.00 mg／kg）。所有實驗都是根據動物實驗3R原則制定的，并且得到了倫理委員會的批準。

1.3 大鼠心臟MI／R模型的構建 參考相關文獻，構建大鼠MI／R模型。SD大鼠靜脈注射氯胺酮（80 mg／kg）和甲苯噻嗪 （20 mg／kg）麻醉。肝素（1 500 IU／kg）同時靜脈注射以防止冠狀動脈內血栓形成。將大鼠心臟迅速從胸腔取出，隨后放入4℃肝素化Krebs-Henseleit（K-H）溶液中。然后，將離體心臟從主動脈根部懸吊在Langendorff灌注裝置上，在 37℃、75 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）的恒定壓力下用95% O+5% CO飽和的K-H溶液灌注。將充滿液體的乳膠球囊經左心房植入左心室，并與壓力傳感器相連。所有的心臟都經歷了30 min的缺血，然后是120 min的再灌注。

1.4 小動物超聲儀檢測大鼠心率（heart rate，HR）及左心室縮短分數（shortened fraction，FS） 大鼠在3%異氟烷吸入麻醉下脫毛，仰臥位固定于恒溫加熱板上，持續吸入1.5%～2.5%異氟烷，四肢與心電圖電極相連用于檢測HR并記錄心電圖，各參數連續測量3次，計算均值。

1.5 酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 采用ELISA試劑盒檢測CKMB和cTnI的含量。根據說明書進行操作，往預先包被大鼠SOD抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育，并徹底洗滌。所有孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15 min。所有孔加入終止液50μl。使用多功能酶標儀在450 nm處檢測吸光度。

1.6 HE染色 二甲苯脫蠟組織切片，進行2次，每次10 min。依次在100%、90%、80%、70%乙醇中各浸泡3 min。再用蘇木精染色2 min，1%鹽酸乙醇分化10 s，稀氨水返藍20 s，伊紅染色3 min。以上每個步驟處理后均使用去離子水沖洗3次，每次各1 min。再依次經過70%、80%、90%、100%乙醇脫水，每個梯度各5 min。二甲苯透明2次，每次10 min，之后用中性樹脂封片。顯微鏡觀察染色結果并拍照記錄。隨機請5名病理醫師針對染色質量評分，根據細胞核（滿分9分）、細胞質（滿分9分）的評分標準進行判讀評分，總和為該切片的質量得分。

1.7 Weston blot 用10%SDS-PAGE分離細胞和腫瘤中的蛋白，并轉移到PVDF膜上。在被5%脫脂牛奶封閉后，蛋白質與第一抗體在4℃下孵育過夜。主要抗體如下：Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Actin、p65、p-p65、ERK1／2、p-ERK1／2。PBS洗滌，羊抗兔IgG-HRP孵育1 h。用ECL化學發光檢測試劑盒觀察這些條帶。

1.8 試劑盒檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醇（malondialdehyde，MDA）含量 采用試劑盒檢測SOD活性和MDA含量。根據SOD和MDA試劑盒操作說明進行實驗。在450 nm處測定吸光值。

2 結果

2.1 白芷乙素對MI／R大鼠心臟功能及損傷的影響 超聲檢測大鼠心臟功能。如圖1A、B所示，與Control組［HR（415±26）次／分鐘、FS（35.0±2.8）%］比較，MI／R組的 HR（234±46）次／分鐘和FS（15.7±3.0）%均降低，差異有統計學意義（t＝8.346，P＜0.05；t＝11.85，P＜0.05）；與 MI／R組比較，中、高劑量白芷乙素組的 HR［（304±35）、365±38）次／分鐘］和 FS［（26.6±3.5）%、（31.5±2.7）%］升高，差異有統計學意義（F＝13.51，P＜0.05；F＝43.72，P＜0.05）。ELISA檢測大鼠心臟損傷指標，如圖1C、D所示，與 Control組［CK-MB（24.6±6）U／L、cTnI（0.10±0.054）ng／ml］比較，MI／R組的 CK-MB（125.6±16）U／L和 cTnI（0.71±0.060）ng／ml升高，差異有統計學意義（t＝14.1，P＜0.05；t＝18.83，P＜0.05）；與 MI／R組比較，中、高劑量白芷乙素組的 CK-MB［（88.5±10）、（46.9±17）U／L］和 cTnI［（0.42±0.060）、（0.15±0.040）ng／ml］降低，差異有統計學意義（F＝37.04，P＜0.05；F＝146.1，P＜0.05）。由此表明，白芷乙素可改善MI／R大鼠心臟功能損傷。

圖1 白芷乙素給藥后的MI／R大鼠心臟功能的檢測

2.2 白芷乙素對MI／R大鼠心肌組織病理變化的影響 HE染色觀察大鼠心肌組織病變情況。如圖2所示，Control組心肌組織排列整齊，形態清晰；MI／R組心肌形態紊亂，結構松散，有炎細胞浸潤；與MI／R組比較，中、高劑量白芷乙素組的細胞間隙逐漸減小，排布整齊均勻。由此可見，白芷乙素可改善MI／R大鼠心肌病變損傷。

圖2 白芷乙素給藥后的MI／R大鼠心肌損傷的HE染色 ×400

2.3 白芷乙素對MI／R大鼠心肌細胞凋亡的影響TUNEL檢測大鼠心肌細胞凋亡的情況。如圖3所示，與Control組（2±2）%比較，MI／R組的凋亡細胞（47±7）%增加，差異有統計學意義（t＝15.49，P＜0.05）；與MI／R組比較，中、高劑量白芷乙素組的凋亡細胞［（21±6）、（11±4）%］減少，差異有統計學意義（F＝60.28，P＜0.05）。由此表明，白芷乙素可抑制MI／R大鼠心肌凋亡。

圖3 白芷乙素給藥后的MI／R大鼠心肌細胞的TUNEL染色 ×400

2.4 白芷乙素對MI／R大鼠細胞凋亡相關蛋白表達的影響 Western blot檢測大鼠細胞凋亡相關蛋白的表達。如圖4所示，與Control組的 Bax／Bcl-2和 cleaved caspase-3／caspase-3表達比值［（0.02±0.005）、（0.01±0.007）］比較，MI／R組的 Bax／Bcl-2和 cleavedcaspase-3／caspase-3表達比值［（10.7±0.87）、（0.46±0.04）］升高，差異有統計學意義（t＝30.18，P＜0.05；t＝26.81，P＜0.05）；與 MI／R組比較，中、高劑量白芷乙素組的 Bax／Bcl-2［（0.68±0.07）、（0.12±0.04）］和 cleaved caspase-3／caspase-3［（0.12±0.043）、（0.03±0.015）］表達比值降低，差異有統計學意義（F＝537.1，P＜0.05；F＝146.8，P＜0.05）。可見，白芷乙素可抑制凋MI／R大鼠凋亡相關蛋白的表達，從而抑制細胞凋亡。

圖4 白芷乙素給藥后的MI／R大鼠凋亡相關蛋白的Western blot檢測

2.5 白芷乙素對MI／R大鼠SOD活性和MDA含量的影響 試劑盒檢大鼠SOD活性和MDA含量。如圖5A所示，與 Control組（4.6±0.5）U／ml比較，MI／R組的 SOD活性（2.2±0.54）U／ml降低，差異有統計學意義（t＝8.003，P＜0.05）；與 MI／R組比較，中、高劑量白芷乙素組的 SOD活性［（3.1±0.5）、（4.0±0.6）U／ml］升高，差異有統計學意義（F＝15.75，P＜0.05）。如圖5B所示，與 Control組（2.1±0.54）mmol／ml比較，MI／R組的 MDA含量（4.5±0.46）mmol／ml升高，差異有統計學意義（t＝8.226，P＜0.05）；與 MI／R組比較，中、高劑量白芷乙素組的 MDA含量［（3.65±0.5）、（2.48±0.4）mmol／ml］降低，差異有統計學意義（F＝20.77，P＜0.05）。由此說明，白芷乙素可促進SOD活性并抑制MDA含量，從而緩解MI／R大鼠的氧化應激。

圖5 白芷乙素給藥后的MI／R大鼠SOD活性和MDA含量的檢測

2.6 白芷乙素對 MI／R大鼠 ERK1／2和 NF-κB p65通路蛋白活化的影響 Western blot檢測通路蛋白。如圖 6所示，與 Control組［p-p65（0.02±0.013）、p-ERK1／2（0.02±0.015）］比較，MI／R組的 p-p65（0.67±0.07）和 p-ERK1／2（0.42±0.056）表達升高，差異有統計學意義（t＝22.23，P＜0.05；t＝16.87，P＜0.05）；與 MI／R組比較，中、高劑量白芷乙素組的 p-p65［（0.22±0.06）、（0.08±0.04）］和 p-ERK1／2［（0.16±0.05）、（0.05±0.03）］表達降低，差異有統計學意義（F＝171.7，P＜0.05；F＝72.24，P＜0.05）。由此可見，白芷乙素可抑制ERK1／2和NF-κB p65通路蛋白的表達，從而抑制信號通路的活化。

圖6 白芷乙素給藥后的MI／R大鼠ERK 1／2和NF-κB p65通路蛋白活化的Western blot檢測

3 討論

MI／R損傷是指心肌缺血后恢復血液供應，心肌不能恢復正常的功能和結構。臨床癥狀表現為心律失常、心肌昏迷、心功能障礙、心肌細胞損傷、內皮和微血管功能障礙。已有大量研究表明，多種天然化合物對心肌損傷有保護作用。Chen et al報道，小檗堿對川烏引起的急性心肌損傷和烏頭堿引起的心律失常有預防作用。也有研究表明，異冬氨醇通過激活保護性自噬來減輕阿霉素誘導的心肌損傷。Zeng et al的數據表明，椴苷對 MI／R損傷起保護作用。本研究結果顯示，白芷乙素可降低MI／R大鼠HR、FS及心肌損傷指標CK-MB和cTnI，可見其對MI／R損傷有保護作用。

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在生物系統中不斷產生和消除，需要驅動調控通路。在正常生理條件下，細胞通過平衡ROS的產生和清除來控制ROS水平。而過量的ROS會損害細胞蛋白、脂質和DNA，導致細胞發生致命損傷。SOD是抗氧化體系中最主要的抗氧化劑之一，其可清除體內的ROS，而MDA是膜脂代謝的終產物。在MI／R損傷中，SOD活性降低而MDA含量增加。本研究的數據顯示，白芷乙素提高SOD活性，降低MDA含量，表明其緩解MI／R大鼠的氧化應激狀態。

MI／R損傷涉及MAPK、PI3K和AKT信號通路的復雜網絡。經典的MAPK信號通路可分為三個分支：ERK、JNK和p38。這三個級聯都參與了心肌細胞凋亡的調節。炎癥是一種宿主對外界刺激或組織損傷的應答，與多種細胞因子相關。TNF-α是炎癥反應的中介，其促炎效應主要是由于它能夠激活NF-κB。NF-κB負責編碼多種促炎因子和趨化因子的轉錄。本研究結果證實，白芷乙素阻礙了ERK1／2和 NF-κB p65的磷酸化，抑制通路活化，進而抑制MI／R大鼠心肌細胞凋亡。

綜上所述，白芷乙素可通過抑制ERK1／2和NF-κB p65通路蛋白的磷酸化來阻礙通路活化，進而緩解MI／R大鼠的氧化應激和心肌損傷。