miR-33-5p靶向調控JNK1／c-Jun通路降低口腔鱗狀細胞癌多重耐藥性

韓永潔，王興國，鄧 璐，杜蔚蔚

口腔癌是全球最常見的十種癌癥之一，盡管研究和治療不斷取得新的進展，但在過去幾年中生存率并未顯著提高?；熓侵委熆谇话┑闹饕椒ㄖ唬欢[瘤細胞對化療藥物產生的耐藥性是影響該方法療效的主要難題。腫瘤多重耐藥有著復雜的機制，多重耐藥基因（multidrug resistance gene 1，MDR1）表達產生的 P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是其中的關鍵因子。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），在諸多文獻中報道了其與多重耐藥性的關系，基于JNK1的靶向治療有望成為新的治療方案。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一種長度約為23個堿基的小分子單鏈RNA，對機體的基因表達調控具有重要作用，廣泛運用于惡性腫瘤的早期診斷和靶向治療。通過生物信息學預測，miR-33-5p與JNK1存在可能的靶向結合位點，因此，該研究擬通過人舌鱗癌細胞株CAL-27構建耐藥細胞株，研究miR-33-5p靶向JNK1對耐藥細胞的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養 人舌鱗癌細胞株CAL-27（中國科學院上海細胞庫），在5% CO的37℃環境溫度下，培養于10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基中。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基、胎牛血清購自美國 Hyclone公司，卡鉑（carboplatin，CBP）、順鉑（cisplatin，DDP）、紫杉醇（paclitaxel，PTX）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）購自齊魯制藥有限公司，Trizol試劑、RIPA試劑、BCA試劑盒、MTT試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，Taqman miRNA RT及universal master mix試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，lipofectamine 2000試劑購自美國Thermo Fisher公司，熒光素酶報告試劑盒購自美國Promega公司，Rh123試劑購自美國 Sigma公司，miR-33-5p mimic及其 inhibitor、scramble inhibitor由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，實驗所用一抗購自英國Abcam公司，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與處理方法 將CAL-27細胞分為 CAL-27組、CAL-27／CBP組、CAL-27／CBP+scramble inhibitor組、CAL-27／CBP+miR-33-5p inhibitor組。除CAL-27組細胞外，其余各組細胞通過CBP誘導耐藥細胞株，之后按照lipofectamine 2000的操作說明，將作為陰性對照的scramble inhibitor轉染進入CAL-27／CBP+scramble inhibitor組細胞，將miR-33-5p inhibitor轉染進入CAL-27／CBP+miR-33-5p inhibitor組細胞，轉染48 h后進行后續檢測。

1.2.2 耐藥細胞株建立 使用CBP誘導耐藥細胞株，將CAL-27細胞株培養于藥物濃度0.3μg／ml的培養液中，3 d后更換正常培養液培養2 d，當細胞生長成片時遞增劑量，持續加藥誘導6個月，當細胞能夠在10μg／ml藥物濃度下正常生長傳代，即為耐藥細胞株 CAL-27／CBP。

1.2.3 耐藥細胞形態鑒定 取對數生長期的CAL-27、CAL-27／CBP細胞接種于培養瓶中進行繼續培養，待細胞貼壁后在顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.2.4 細胞生長曲線測定 將對數生長期的細胞按1×10個／孔接種于24孔板中，正常條件下進行培養，每隔24 h對細胞計數一次，連續計數7 d，以時間為橫坐標，細胞數為縱坐標，制作生長曲線。

1.2.5 MTT法檢測細胞活力 將貼壁生長的細胞制成單細胞懸液，接種于96孔板，每組3個復孔，正常條件下培養24 h，更換含對應濃度的化療藥物的培養基繼續培養72 h，MTT試劑盒檢測570 nm吸光度（A值），計算細胞活力。細胞活力 ＝（實驗孔A值-空白孔A值）／（陰性對照孔A值-空白孔 A值）×100%。

1.2.6 RT-PCR檢測基因表達 Trizol提取各組細胞總RNA，反轉錄試劑盒合成cDNA，通過universal mastermix試劑盒提供的方法進行PCR反應，反應條件為：Stage 1：95℃ 10 min，Stage 2：95℃ 10 s，60℃ 60 s，40個循環，結果采用 2法進行計算。

1.2.7 熒光素酶報告實驗檢測miR-33-5p和JNK1靶向關系 生物信息學網站Targetscan預測miR-33-5p和JNK1的靶向結合位點，構建JNK1 pGL3 luciferase promoter野生型（WT）和突變型（MUT）載體，分別和 miR-33-5p mimic和mimic NC共轉染細胞，轉染48 h后檢測熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達 RIPA溶液抽提各組細胞總蛋白，BCA試劑盒定量，每孔30μg上樣量上樣，10%SDS-PAGE分離各組蛋白后轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，適量一抗4℃孵育過夜，第2天加入適量二抗孵育2 h，滴加ECL顯色液進行曝光顯影，凝膠成像儀下拍照并分析條帶灰度進行相對定量。

1.2.9 Rh123聚集分析 各組細胞制成200μl 2×10個／ml的單細胞懸液，加入 10μg／ml Rh123于37℃孵育30 min。清洗后正常培養基重懸37℃培養30 min，清洗后重懸于加入了2μg／ml PI的PBS緩沖液中。流式細胞儀488 nm激發光檢測細胞Rh123聚集，計數Rh123陽性細胞數。

2 結果

2.1 CAL-27／CBP耐藥細胞株的鑒定 對耐藥細胞進行形態鑒定，細胞株CAL-27形態較為規則，細胞形態多呈圓形或橢圓形，大小均一；耐藥細胞株CAL-27／CBP細胞大小不一，細胞形態呈多角形，部分細胞體積增大，胞質豐富，見圖1A；與CAL-27細胞株比較，CAL-27／CBP細胞株生長緩慢，差異有統計學意義（t＝2.996，P＝0.020 1），見圖1B。

圖1 CAL-27／CBP耐藥細胞株鑒定

2.2 親本細胞和耐藥細胞對不同化療藥物的敏感性 用濃度梯度遞增的CBP持續作用于CAL-27細胞建立了CAL-27／CBP細胞株，使用多種化療藥物檢測CAL-27／CBP細胞株的多重耐藥性，CAL-27／CBP耐藥細胞株對化療藥物 CBP、DDP、PTX和5-FU的敏感性均低于CAL-27親本細胞株，差異有統計學意義（CBP：t＝2.972，P＝0.041 0；DDP：t＝3.172，P＝0.033 8；PTX：t＝2.972，P＝0.041 1；5-FU：t＝3.002，P＝0.039 9），見圖2。

圖2 MTT檢測CAL-27、CAL-27／CBP細胞株對多種化療藥物的敏感性

2.3 miR-33-5p與JNK1的靶向作用關系 通過生物信息學數據庫Targetscan預測了miR-33-5p與JNK1 3′端UTR結構可能存在靶向作用關系，見圖3A。與 CAL-27細胞株比較，CAL-27／CBP細胞株miR-33-5p表達水平升高，差異有統計學意義（t＝15.56，P＝0.000 0），見圖 3B。熒光素酶報告實驗顯示，與 JNK1 WT+mimics NC比較，JNK1 WT+miR-33-5p的熒光素酶活性下降，差異有統計學意義（t＝4.704，P＝0.000 8）；而 JNK1 MUT+mimics NC與JNK1 MUT+miR-33-5p比較無明顯差異，見圖3C。

圖3 miR-33-5p和JNK1的靶向作用關系

2.4 miR-33-5p對 JNK1／c-Jun通路的抑制作用與 CAL-27組比較，CAL-27／CBP組細胞中 miR-33-5p表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與 CAL-27／CBP組 比較，CAL-27／CBP+scramble inhibitor組細胞中miR-33-5p表達水平無明顯差異，CAL-27／CBP+miR-33-5p inhibitor組細胞中miR-33-5p表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.01）（F＝122.5，P＝0.000 0），見圖 4A。與CAL-27組比較，CAL-27／CBP組細胞中 JNK1、p-JNK1、c-Jun和p-c-Jun蛋白水平均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與 CAL-27／CBP組比較，CAL-27／CBP+scramble inhibitor組 細胞 中 JNK1、p-JNK1、c-Jun和p-c-Jun蛋白水平無明顯差異，CAL-27／CBP+miR-33-5p inhibitor組細胞中 JNK1、p-JNK1、c-Jun和p-c-Jun蛋白水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）（JNK1：F＝17.80，P＝0.000 0；p-JNK1：F＝96.56，P＝0.000 0；c-Jun：F＝18.46，P＝0.000 0；p-c-Jun：F＝33.69，P＝0.000 0），見圖 4B。

圖4 miR-33-5p對JNK 1／c-Jun通路抑制作用

2.5 miR-33-5p對CAL-27／CBP細胞多重耐藥性的影響 對各組細胞對不同化療藥物的IC進行計算，結果見表1。與CAL-27組細胞比較，CAL-27／CBP組細胞對不同化療藥物的IC均增加，差異有統計學意義；與CAL-27／CBP組細胞比較，CAL-27／CBP+scramble inhibitor組細胞對不同化療藥物的IC無明顯差異，CAL-27／CBP+miR-33-5p inhibitor組細胞對各化療藥物的IC均下降，差異有統計學意義。

表1 各組細胞多重耐藥性比較（n＝3，μg／ml）

2.6 miR-33-5p對多重耐藥基因MDR1表達的影響 CAL-27／CBP組細胞Rh123陽性百分比低于CAL-27細胞，差異有統計學意義（P＜0.01）；而CAL-27／CBP+scramble inhibitor組細胞相較于CAL-27／CBP組細胞Rh123陽性百分比無明顯差異，CAL-27／CBP+miR-33-5p inhibitor組細胞相較于CAL-27／CBP組細胞Rh12陽性百分比升高，差異有統計學意義（F＝332.7，P＝0.000 0），見圖 5A。與CAL-27組比較，CAL-27／CBP組細胞MDR1蛋白水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與CAL-27／CBP組比較，CAL-27／CBP+scramble inhibitor組細胞MDR1蛋白水平無明顯差異，CAL-27／CBP+miR-33-5p inhibitor組細胞MDR1蛋白水平降低，差異有統計學意義（F＝76.01，P＝0.000 0），見圖5B。

圖5 miR-33-5p對多重耐藥基因MDR1的調控作用

3 討論

多重耐藥性是指腫瘤細胞對一種化療藥物產生抗藥性后，對化學結構和作用機制不同的其他多種化療藥物產生交叉耐藥的現象。隨著化療藥物應用的普及，腫瘤細胞的多重耐藥性已逐漸成為化療失敗的重要原因，這一特性是多基因共同作用產生的復雜機制，其中，JNK1與這一過程有著重要聯系。miR-33-5p被發現在 HPV陽性頭頸部鱗狀細胞癌中高表達，參與了腫瘤的發生發展過程。通過生物信息學分析預測顯示，miR-33-5p與JNK1可能存在靶向調控作用，而miR-33-5p和JNK1的靶向作用對口腔癌細胞多重耐藥性的影響還缺乏研究報道。本研究首先通過小劑量逐步增加劑量持續給藥的方法成功建立了CAL-27／CBP耐藥株，并檢測了耐藥株對CBP、DDP、PTX、5-FU等一系列化療藥物表現出耐藥性，結果顯示CAL-27／CBP耐藥株擁有比親本CAL-27細胞株更強的化療藥物耐受性。

JNK1是一種進化上保守的絲／蘇氨酸蛋白激酶，屬于促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的重要成員，因其可被諸如放射線、DNA損傷藥物、活性氧及炎癥細胞因子等多種環境應激因素激活，又被稱為應激激活蛋白激酶。通過磷酸化JNK1的酪氨酸和蘇氨酸殘基而使其發生激活，活化的JNK1可作用于轉錄因子c-Jun的氨基末端使得c-Jun磷酸化激活。轉錄因子c-Jun作用于下游基因啟動子的AP-1位點，調控這些基因的轉錄活性，而這一通路可誘導內源性凋亡相關通路的啟動，進而引起細胞凋亡。啟動子區包含了AP-1位點的MDR1是JNK1／c-Jun下游調控的基因之一，而MDR1基因的過度表達是腫瘤細胞多重耐藥性的關鍵機制之一，臨床化療效果與MDR1表達密切相關，MDR1表達產物P糖蛋白具有將攝入細胞內的藥物轉運出細胞的能力，從而有效降低了化療藥物對腫瘤細胞的毒害作用。研究表明JNK1／c-Jun通路介導的MDR1上游AP-1位點激活對該基因表達起負調控作用，在Choi et al的研究中，通過激活耐藥細胞株的JNK1／c-Jun通路，MDR1的表達受到抑制，從而減少了MCF-7／Dox細胞的多重耐藥性。本研究通過熒光素酶報告系統證實了miR-33-5p和JNK1的靶向作用關系，進一步研究表明，在 CAL-27／CBP耐藥株中miR-33-5p高表達，同時伴隨著JNK1／c-Jun通路的失活，當通過miR-33-5p inhibitor抑制miR-33-5p的表達后，JNK1／c-Jun通路恢復其活化狀態。同時本研究觀察到CAL-27／CBP耐藥株的MDR1蛋白表達水平升高，并且其表達產物P糖蛋白對Rh123的轉運能力也得到提高，當miR-33-5p表達受到抑制時，CAL-27／CBP耐藥株的多重耐藥性減弱、MDR1蛋白表達水平下降、Rh123轉運能力受到抑制，以上結果表明 miR-33-5p可升高 CAL-27／CBP的多重耐藥性。

綜上所述，本研究證實了在CAL-27／CBP耐藥株中，miR-33-5p可靶向作用于 JNK1，從而抑制JNK1的表達，抑制JNK1／c-Jun通路的激活，進而引起MDR1蛋白表達升高，MDR1表達產物P糖蛋白加強了CAL-27／CBP耐藥株的化療藥物轉運出細胞的能力，從而提高了細胞的多重耐藥性。本研究初步探討了miR-33-5p和JNK1／c-Jun通路對CAL-27／CBP多重耐藥性的機制，然而細胞多重耐藥性還存在其他機制，有待后續計劃進行進一步探索。