干擾長鏈非編碼RNA CCAT2對膀胱癌細胞J82線粒體功能和腫瘤干細胞樣特性的影響

白曉靜，蔣玉梅，張 靜，范晉海

膀胱癌屬于泌尿系統疾病，其發病率占惡性腫瘤第11位，是中國泌尿系統發病率、死亡率最高的疾病之一，其中男性發病率稍高于女性。近年來，膀胱癌發病率呈現出增長的趨勢，嚴重影響人們的生命健康安全。目前診斷膀胱癌主要為膀胱鏡檢與尿細胞學聯合檢查，但膀胱鏡檢過程易出現出血、感染風險，尿細胞學檢查準確性易受機體炎癥反應的影響。因此，膀胱癌早期診斷研究逐漸轉向基因相關腫瘤標志物等方面發展。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度 ＞200 bp、無開放閱讀框、異質性強的RNA群體，參與細胞增殖、分化、凋亡等過程。lncRNA UCA1在膀胱癌特異性表達，具有較高的診斷價值，異常表達可以促進膀胱癌細胞侵襲、轉移，可以作為分子標志物。lncRNA CCAT2可以通過調控miR-200b／VEGF在骨肉瘤中充當癌基因，還可以促進EZH2表達促進肝細胞癌HCC細胞增殖、侵襲、轉移，從而促進肝細胞癌進展，但有關lncRNA CCAT2在膀胱癌中的作用研究報道較少。因此，該研究通過干擾膀胱癌細胞J82 lncRNA CCAT2，探索其對J82細胞的影響及可能存在的作用機制，為分子靶向治療提供試驗參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要儀器 膀胱癌細胞J82（美國ATCC），CCAT2-shRNA（前引物 5′-UUA ACC UCU UCC UAUCU-3′，后引物 5′-UGA GAU AGG AAG AGG UUAA-3′）及 shRNA-NC（前引物 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，后引物 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′）載體由上海吉瑪制藥技術有限公司提供，線粒體膜電位檢測試劑盒（Solarbio），Lipofectamine2000（Thermo Fisher Scientific），Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc、TCF4、OCT4、SOX2、CD44／Actin抗體（Cell Signaling Technology），ECL Kit（Thermo Fisher），青霉素（Merck-KGaA），鏈霉素（Darmstadt），DNR BioImaging System（DNR，Israel），10%胎牛血清（Sigma-Aldrich），TRIzol Kit（Thermo Fisher Scientific），SYBR-Green PCR（TAKARA），Revertaid First Strand cDNA Kit（Thermo Fisher）。高速冷凍離心機（Beckman Coulter），實時熒光定量PCR儀（羅氏），流式細胞分析儀（貝克曼庫爾特）。

1.2 細胞培養與轉染試驗 膀胱癌細胞J82培養于含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素或鏈霉素的完全PRMI1640培養液培養，并在37℃的5% CO的加濕培養箱中培養至對數期，0.25%胰蛋白酶消化液處理制成細胞懸液，采用第3代細胞用于后續實驗。采用 Lipofectamine2000將 CCAT2-shRNA、shRNA-NC載體轉染J82細胞并分別記為CCAT2-shRNA組和shRNA-NC組，不作任何處理的J82細胞記為Control組，RT-PCR驗證各組細胞中CCAT2表達量。

1.3 克隆形成檢測細胞增殖 將各組J82細胞以500個／孔細胞梯度接種于6孔板，連續培養2周后，移除培養基并用PBS洗滌細胞，再用4%多聚甲醛固定20 min，0.2%結晶紫染色5 min，純水洗滌細胞晾干，于顯微鏡觀察，圖像采集，計算出克隆形成率，克隆形成率＝克隆細胞數／總細胞數×100%。

1.4 流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化 將各組J82細胞懸液密度調整為1×10個／ml，接種于6孔板中、400μl／孔，每組3個復孔，培養48 h后收集各組細胞，加入1 ml JC-1染色液，37℃下避光孵育15 min，1 000 r／min離心5 min，棄上清液，采用預冷的1×JC-1染色緩沖液沖洗，加入0.5 ml緩沖液，采用流式細胞儀檢測JC-1熒光信號。正常線粒體膜電位較高，極性較高，熒光為紅色；當線粒體受損時，線粒體膜電位下降，熒光為綠色。

1.5 Western blot檢測方法 提取培養48 h的各組J82細胞總蛋白，采用Bradford調整各組蛋白濃度一致，經SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至 PVDF膜，密封 2 h，加入兔抗人 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc、OCTA、SOX2、CD44、Actin一抗（1∶500）4℃孵育過夜，TBST漂洗 40 min，加入HRP標記的二抗（1∶500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL試劑盒與DNR BioImaging System觀察膜上蛋白條帶，收集影像，采用凝膠圖像處理系統軟件分析各組條帶灰度值，依據相對灰度值進行統計學分析。

1.6 RT-PCR檢測 TRIzol試劑提取J82細胞總RNA，Revertaid First Strand cDNA合成試劑盒將RNA中反轉錄合成cDNA，SYBR-Green PCR Mix檢測mRNA的表達水平。PCR參數設置：95℃5 s，60℃ 34 s、40個循環，CCAT2引物（前引物 5′-CCC TGG TCA AAT TGC TTA ACC T-3′，后引物 5′-TTA TTC GTC CCT CTG TTT TATGGA T-3′）、actin（前引物 5′-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TTC-3′，后引物5′-ATC CGT TGA CTC CGA CCT TCA C-3′）由上海生工設計提供，采用2法分析基因表達量。

1.7 腫瘤成球情況檢測 將各組J82細胞置于DMEM／F12培養基培養（含有20 ng／ml EGF、20 ng／ml bFGF、20μl／ml B27、100μg／ml鏈霉素、100 U／ml青霉素），制備成單細胞懸液，采用流式儀分選統計細胞數目（重復3次），將分選后的細胞鋪低黏附96孔板，每孔含有100μl成球培養基，并含有10個細胞，設置10個復孔，培養2周后，于顯微鏡下觀察測量球體直徑，統計每100個細胞的球數。

1.8 流式細胞儀檢測干細胞標記物CD133陽性細胞 將各組J82細胞培養48 h后，收集細胞，并用胰蛋白酶消化，細胞懸液中加入高糖DMEM（含有10%FBS），1 500 r／min離心 5 min，棄上清液，采用PBS清洗3遍，加入10μl CD133-PE抗體或其相對應的同型對照，4℃室溫避光孵育20 min，PBS洗滌2次，然后300μl PBS重懸細胞并混勻，流式細胞儀上機分析CD133情況。

2 結果

2.1 shRNA干擾 lncRNA CCAT2表達量 RTPCR驗證 采用lncRNA CCAT2短發卡RNA（shRNA）干擾 CCAT2表達，產生 CCAT2-shRNA1、CCAT2-shRNA2、CCAT2-shRNA3三種 CCAT2-shRNA J82細胞系，RT-PCR檢測三種 CCAT2-shRNA J82細胞系中CCAT2表達量，結果顯示CCAT2-shRNA1、CCAT2-shRNA2、CCAT2-shRNA3 J82細胞系中的 CCAT2相對表達量分別為（0.36±0.07）、（0.11±0.05）、（0.47±0.06），均低于 shRNA-NC的（0.99±0.04）（F＝130.627，P＜0.05），其中CCAT2-shRNA2 J82細胞中的CCAT2表達量最低，選擇CCAT2-shRNA2 J82細胞用于后續實驗研究。見圖1。

圖1 shRNA干擾lncRNA CCAT2表達量RT-PCR驗證

2.2 shRNA干擾lncRNA CCAT2對膀胱癌細胞J82增殖的影響 采用克隆形成實驗觀察各組細胞增殖情況，結果顯示 Control、shRNA-NC、CCAT2-shRNA J82細胞克隆形成率分別為（84±11）%、（80±9）%、（11±7）%，三組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；CCAT2-shRNA組中克隆形成率低于shRNA-NC組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 shRNA干擾lncRNA CCAT2對膀胱癌細胞J82增殖的影響

2.3 shRNA干擾lncRNA CCA對膀胱癌細胞J82細胞線粒體膜電位變化的影響 采用流式細胞儀檢測各組細胞線粒體膜電位變化情況，Control、shRNA-NC、CCAT2-shRNA J82細胞的綠色熒光強度分為0.8%、1.1%、24.7%，CCAT2-shRNA組細胞中綠色熒光強度高于Control組、shRNA-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 shRNA干擾lncRNA CCA對膀胱癌細胞J82細胞線粒體膜電位變化的影響

2.4 shRNA干擾lncRNA CCA對凋亡相關蛋白水平的影響 采用Western blot檢測各組J82細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc水平，結果顯示，與 shRNA-NC組比較，CCAT2-shRNA組 Bax／Bcl-2（4.600±0.004）、Caspase-3（0.160±0.025）、Caspase-9水平（0.170±0.020）升高（P＜0.05），c-Myc水平（0.006±0.000 3）降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；Control組與 shRNA-NC組細胞中各凋亡相關蛋白水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 4。

圖4 shRNA干擾lncRNA CCA對凋亡相關蛋白水平的影響

2.5 shRNA干擾lncRNA CCA對腫瘤成球的影響 顯微鏡檢結果顯示，CCAT2-shRNA組成球直徑（12±8）μm及成球率為（11±6）%均低于 shRNA-NC組（139±25）μm、（78±9）%，差異有統計學意義（P＜0.05），Control組、shRNA-NC組成球直徑及成球率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 shRNA干擾lncRNA CCA對腫瘤成球的影響

2.6 shRNA干擾lncRNA CCA對CD133表達的影響 Control、shRNA-NC、CCAT2-shRNA J82細胞中的 CD133陽性率分別為（14.50±2.00）%、（13.27±3.00）%、（1.06±0.70）%，三組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；CCAT2-shRNA組CD133陽性率低于 shRNA-NC組（t＝9.973，P＜0.05），Control組、shRNA-NC組CD133陽性細胞數目比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 shRNA干擾lncRNA CCA對CD133表達的影響

2.7 shRNA干擾 lncRNA CCA對 OCT4、SOX2、CD44水平的影響 CCAT2-shRNA組OCT4、SOX2、CD44水平分別為（0.020±0.010）、（0.010±0.005）、（0.040±0.014），均低于 shRNA-NC組的（0.711±0.070）、（0.350±0.045）、（0.490±0.060），差異有統計學意義（P＜0.05），Control組、shRNA-NC組 OCT4、SOX2、CD44水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 shRNA干擾lncRNA CCA對OCT4、SOX2、CD44水平的影響

3 討論

lncRNA是指轉錄本長度超過200核苷酸的ncRNA，在細胞增殖、周期和凋亡等生理活動中發揮重要作用，其在腫瘤組織呈異常表達與腫瘤發生、發展密切相關。 Martens-Uzunova et al通 過PubMed數據庫大量文獻分析發現lncRNA是細胞生長、增殖、分化重要調節劑，其功能改變會促進膀胱癌發生、侵襲和轉移，是泌尿系統惡性腫瘤的非侵入性潛在腫瘤標志物之一，有望成為未來腫瘤的治療靶標。CCAT2是染色體8q24區新發現的 lncRNA，在結直腸癌組織高表達，促進腫瘤生長、轉移，降低CCAT2表達量可抑制乳腺癌細胞生長，并且lncRNA CCAT2表達量與乳腺癌分期相關。越來越多研究通過shRNA探究某個基因對惡性腫瘤細胞生物學的影響，如shRNA介導泛素相關結構域樣蛋白2沉默可抑制膀胱癌細胞增殖。本研究通過shRNA干擾lncRNA CCAT2使其在膀胱癌細胞J82中呈低表達狀態，發現lncRNA CCAT2低表達可降低J82細胞克隆形成率，表明lncRNA CCAT2低表達可抑制J82細胞生長，而腫瘤生長與細胞增殖、凋亡有關，lncRNA CCAT2低表達可能會影響J82細胞增殖、凋亡。

Myc在多種腫瘤組織中呈高表達，其基因產物可調控多種蛋白質編碼，其下游基因參與細胞周期、分化、轉化等過程，lncRNA-c-Myc調控途徑可促進腫瘤轉移。線粒體在細胞凋亡途徑中具有重要作用，Bcl-2家族蛋白主要分布于線粒體膜上，與成孔蛋白相互作用，形成陰離子通道，改變線粒體膜結構，促進Ca、凋亡誘導因子等進入細胞基質，激活細胞凋亡級聯反應。線粒體膜電位主要是由線粒體內膜形成，影響線粒體ATP合成、Ca水平穩態、活性氧產生，線粒體膜電位去極化可誘導細胞凋亡。Bax、Bcl-2在細胞凋亡過程中具有重要意義，兩者拮抗調節細胞凋亡。Caspases-9、Caspases-3均是Caspases家族成員之一，其水平升高促進細胞凋亡。本研究結果發現shRNA干擾lncRNA CCAT2可增強細胞線粒體膜電位去極化，提高Bax／Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9水平，降低 c-Myc水平。Cai et al發現沉默CCAT2可以抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲，降低 c-Myc表達量，抑制 Wnt／β-catenin信號通路激活。Sarrafzadeh et al研究顯示CCAT2可增強c-Myc調控mRNA表達量，促進腫瘤侵襲和轉移。Li et al認為CCAT2低表達可抑制膀胱癌細胞生長、遷移，促進細胞凋亡。本研究結果與上述研究結果趨勢相似，表明lncRNA CCAT2低表達可抑制膀胱癌細胞J82增殖，促進細胞凋亡，可能與降低c-Myc表達量，提高粒體膜電位去極化，誘導線粒體膜結構變化有關，促進促凋亡因子進入胞基質，誘導細胞凋亡。

腫瘤臨床治愈難度大是因為腫瘤干細胞貫穿于腫瘤發生、發展、復發與轉移過程，靶向藥物主要以此類細胞作為作為靶細胞。本研究發現lncRNA CCAT2低表達降低J82細胞的成球率和成球直徑，提示lncRNA CCAT2低表達可抑制J82細胞成瘤能力。CD133是含有5跨膜細胞表面糖蛋白，在細胞、器官成熟時發揮轉錄調控作用，最早作為造血干細胞、造血祖細胞的表面標致物，如今常作為腫瘤干細胞標志物。本研究發現lncRNA CCAT2低表達降低J82細胞CD133陽性率，表明lncRNA CCAT2低表達可能影響腫瘤干細胞樣特性。本研究發現lncRNA CCAT2低表達降低腫瘤干細胞樣特性標志物OCT4、SOX2、CD44水平。CD44是與多種惡性腫瘤的發生、進展有關的黏附因子，OCT4和SOX2均為多能干細胞標志物。由此表明，lncRNA CCAT2低表達可降低膀胱癌腫瘤干細胞樣特性，從而影響腫瘤細胞生長。

綜上所述，shRNA干擾lncRNA CCAT2可以抑制膀胱癌細胞J82的生長、促進細胞凋亡，可能與增強線粒體膜去極化、降低線粒體功能和誘導細胞凋亡有關，還可能與降低腫瘤干細胞特性有關。