七氟醚后處理對氧糖剝奪／復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)HT22細(xì)胞DNA損傷及SIRT1表達(dá)的影響

舒見威，黃春霞，張 麗，胡憲文

失血性休克是臨床常見的危重癥之一，再灌注后因恢復(fù)供氧而產(chǎn)生的過量自由基，對神經(jīng)細(xì)胞的損害主要涉及DNA損傷，如果機(jī)體不能有效修復(fù)DNA損傷，則可導(dǎo)致細(xì)胞突變積累甚至凋亡。SIRT1是NAD依賴的賴氨酸脫乙酰化酶，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而影響DNA的損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等生物過程。新近研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可通過影響 PARP1活性參與核 DNA損傷的修復(fù)，使PGC1α脫乙酰基參與調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)。七氟醚是揮發(fā)性全身吸入性麻醉藥，其預(yù)處理或者早期后處理對缺血性腦損傷有著直接的神經(jīng)保護(hù)作用，然而七氟醚發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用具體機(jī)制尚未研究清楚。該課題組前期研究表明，七氟醚后處理可以抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的開放，減少凋亡相關(guān)蛋白從線粒體釋放到細(xì)胞胞質(zhì)，減輕神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而改善失血性休克復(fù)蘇引起大鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力損傷。該研究擬利用HT22細(xì)胞系，建立氧糖剝奪／復(fù)氧復(fù)糖（oxygen and glucose deprivation／reoxygenation，OGD／R）模型模擬體內(nèi)的失血性休克復(fù)蘇過程，以探究七氟醚后處理對 OGD／R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞DNA損傷及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 HT22細(xì)胞系購于武漢普諾塞（Procell）公司。

1.1.2 試劑 胎牛血清（貨號S711-002S），購自Lonsera公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；七氟醚（貨號：83291），購自艾伯維公司；RIPA裂解液（貨號：P0013B），BCA試劑盒（貨號：P0012），購自Beyotime公司；β-actin單克隆抗體 （貨號：66009IIg），購自Proteintech公司；SIRT1單克隆抗體（貨號：9475S），購自美國 Cell Signaling Technology公司；ECL顯影液（貨號：34095），購自美國Thermo公司。

1.1.3 儀器 CO細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），細(xì)胞缺氧小室（加拿大 Stem Cell公司）；氣體濃度監(jiān)測儀（深圳邁瑞生物公司）；七氟醚揮發(fā)罐（德國Drager公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 HT22細(xì)胞系培養(yǎng) HT22細(xì)胞37℃水浴復(fù)蘇后，培育在含10%南美胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待HT22細(xì)胞培育2代后，細(xì)胞融合度到70%時(shí)進(jìn)行OGD／R模型的建立。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與HT22細(xì)胞OGD／R模型的建立 取對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞，采用隨機(jī)數(shù)表法分為7組：空白對照組（CON）、氧糖剝奪／復(fù)氧復(fù)糖4 h組（OGD／R 4 h）、氧糖剝奪／復(fù)氧復(fù)糖4 h+1%七氟醚后處理組（OGD／R 4 h+1%SEVO）、氧糖剝奪／復(fù)氧復(fù)糖4 h+2%七氟醚后處理組（OGD／R 4 h+2%SEVO）、氧糖剝奪／復(fù)氧復(fù)糖 6 h組（OGD／R 6 h）、氧糖剝奪／復(fù)氧復(fù)糖6 h+1%七氟醚后處理組（OGD／R 6 h+1%SEVO）、氧糖剝奪／復(fù)氧復(fù)糖 6 h+2%七氟醚后處理組（OGD／R 6 h+2%SEVO）。對于實(shí)驗(yàn)后續(xù)部分，取第一部分的前面四組進(jìn)一步研究。

棄HT22細(xì)胞的原培養(yǎng)液，PBS洗滌后，加入無糖無血清培養(yǎng)液，放入充有95% N+5% CO的缺氧小室中，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以建立氧糖剝奪模型。HT22細(xì)胞氧糖剝奪處理4 h或6 h后，用含血清的高糖培養(yǎng)液更換原無糖無血清培養(yǎng)液，37℃5% CO繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，即為 OGD／R 4 h，OGD／R 6 h組；七氟醚后處理即復(fù)氧開始即刻缺氧小室內(nèi)充入1%或2%濃度的七氟醚，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后正常培養(yǎng)條件再培養(yǎng)23 h后，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.3 細(xì)胞活力檢測 接種于96孔板中的HT22細(xì)胞，經(jīng)過 OGD／R處理后，加入10μl MTT（5 g／L）溶液后，37℃ ，5% CO培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后加入150μl DMSO室溫振蕩10 min，利用Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀，測定各孔在570 nm和630 nm波長處的吸光值，其差值用以反映細(xì)胞活力。

1.2.4 Western blot法檢測SIRT1、Bcl-2和BAX的表達(dá) 取各實(shí)驗(yàn)組處理結(jié)束后的HT22細(xì)胞，加入RIPA裂解液充分反應(yīng)20 min，13 200 r／min離心30 min后，取上清液，測定各組蛋白濃度，加上樣緩沖液100℃變性10 min，-20℃保存。10%SDSPAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)2 h，室溫5%脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST洗滌后分別滴加SIRT1、Bcl-2和 BAX一抗（1∶1 000），4℃孵育12 h。TBST洗滌后，加入相應(yīng)二抗（1∶10 000），室溫慢搖60 min，TBST洗滌后，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)量，采用Image J軟件分析目的條帶／對應(yīng)內(nèi)參灰度值，以反映目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.5 免疫熒光檢測 將無菌細(xì)胞爬片多聚賴氨酸包被6 h，細(xì)胞均勻的種于爬片上，然后根據(jù)分組進(jìn)行相應(yīng)處理。處理細(xì)胞爬片4%多聚甲醛固定15 min，然后0.5%Triton X-100室溫處理5 min，再用10%BSA室溫孵育120 min；棄去封閉液后，分別滴加 8-OHdG抗體（1∶400）或 Cleaved-casepase 3（1∶400），濕盒中4℃孵育過夜。次日待爬片恢復(fù)到室溫，用PBS沖洗后，在室溫下與相應(yīng)的免疫熒光二抗共同孵育2 h，然后PBS沖洗，細(xì)胞在DAPI（1∶10 000）溶液中避光孵育20 min，抗熒光淬滅封片液封片。采用LSM800激光共聚焦顯微鏡獲取圖像。

2 結(jié)果

2.1 七氟醚后處理對HT22細(xì)胞OGD／R損傷后細(xì)胞活力的影響 MTT法檢測不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率結(jié)果見圖1。與CON組比較，OGD／R處理后，OGD／R 4 h組及OGD／R 6 h組細(xì)胞存活率均降低（均P＜0.01），表明OGD／R 4 h和OGD／R 6 h均可引起HT22細(xì)胞的損傷。與對應(yīng)時(shí)間OGD／R組比較，經(jīng)1%與2%七氟醚后處理的細(xì)胞存活率均升高（均P＜0.01），且在OGD／R 4 h后給與1%與2%七氟醚后處理的細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 七氟醚后處理對OGD／R損傷后HT22細(xì)胞活力的影響

2.2 七氟醚后處理對HT22細(xì)胞OGD／R損傷后細(xì)胞凋亡及壞死影響 Hoechst-PI法檢測神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及壞死結(jié)果見圖2。與CON組比較，OGD／R 4 h組及OGD／R 6 h組凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞數(shù)量均增多，表明 OGD／R 4 h和 OGD／R 6 h均可誘導(dǎo)HT22細(xì)胞的凋亡壞死；與對應(yīng)時(shí)間的OGD／R組比較，經(jīng)1%與2%七氟醚后處理的HT22細(xì)胞凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)量占比減少。

圖2 Hoechst-PI法檢測七氟醚后處理對OGD／R損傷后HT22細(xì)胞凋亡及壞死的影響 ×200

2.3 七氟醚后處理對HT22細(xì)胞OGD／R損傷后細(xì)胞凋亡影響 TUNEL結(jié)果見圖3。與CON組比較，OGD／R 4 h組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量和Cleavedcaspase3表達(dá)量增多，表明OGD／R可誘導(dǎo)HT22細(xì)胞的凋亡；與OGD／R組比較，經(jīng)1%與2%七氟醚后處理的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量和Cleaved-caspase3表達(dá)量均減少，表明1%與2%七氟醚后處理減輕了OGD／R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖3 七氟醚后處理對OGD／R損傷后HT22細(xì)胞凋亡的影響

2.4 七氟醚后處理對HT22細(xì)胞OGD／R DNA損傷影響 通過免疫熒光檢測DNA損傷指標(biāo)8-OHdG的變化，結(jié)果見圖4。與CON組比較，OGD／R 4 h組8-OHdG含量升高（F＝212.4，P＜0.01），表明OGD／R可引起HT22細(xì)胞的DNA損傷；在OGD／R 4 h后給與1%與2%濃度七氟醚后處理的HT22細(xì)胞8-OHdG含量均減少（均P＜0.01），細(xì)胞DNA損傷程度均明顯減輕，且不同濃度七氟醚之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 七氟醚后處理對OGD／R損傷后HT22細(xì)胞DNA損傷的影響

2.5 七氟醚后處理對 HT22細(xì)胞 OGD／R后SIRT1、Bcl-2及 BAX蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果見圖5。與CON組比較，OGD／R 4 h組SIRT1和Bcl-2表達(dá)減少（均 P＜0.01），BAX表達(dá)增加（P＜0.01）；與 OGD／R 4 h組比較，經(jīng)1%和2%七氟醚后處理的HT22細(xì)胞SIRT1（均P＜0.01）和Bcl-2表達(dá)均增加（P＜0.05，P＜0.01），BAX表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 七氟醚后處理對OGD／R損傷后HT22細(xì)胞SIRT1、Bcl-2、BAX表達(dá)的影響

3 討論

失血性休克因有效循環(huán)血容量減少導(dǎo)致全身組織缺血缺氧，腦組織只能利用葡萄糖氧化供能而發(fā)生能量耗竭，成為最易因缺血／再灌注過程受損傷的器官。臨床上治療失血性休克的首要方法是晶體液迅速恢復(fù)循環(huán)血容量，但血流恢復(fù)的同時(shí)產(chǎn)生的腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI），可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，甚至凋亡、壞死。因此，如何有效抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡對于減輕CIRI具有重要臨床意義。

近年來，許多研究證明七氟醚在CIRI中具有神經(jīng)保護(hù)作用。Zhang et al利用大腦中動脈閉塞大鼠模型和OGD／R體外模型，發(fā)現(xiàn)七氟醚預(yù)處理通過抑制miR-181a促進(jìn)XIAP表達(dá)，降低腦梗死面積，增加細(xì)胞活力，減少LDH釋放，減輕神經(jīng)元凋亡。在其他研究中發(fā)現(xiàn)七氟醚后處理可以減少SHSY5Y細(xì)胞OGD／R過程中的自噬體-溶酶體融合，并減少自噬體的形成，從而減弱了OGD／R誘導(dǎo)的自噬體累積，減輕缺血／再灌注損傷。

本研究利用HT22細(xì)胞作為體外研究七氟醚后處理腦保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)對象，采用OGD／R模擬缺血／再灌注損傷模型。為了確定氧糖剝奪損傷的最佳時(shí)間，將HT22細(xì)胞經(jīng)過4 h或6 h的氧糖剝奪處理，然后再灌注24 h。OGD／R處理后細(xì)胞活力降低，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變（胞體回縮，突觸斷裂），說明OGD／R模型構(gòu)建成功；經(jīng)1%與2%七氟醚后處理的細(xì)胞活力均上升，凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞數(shù)量均降低，且有一定的濃度依賴性，說明不同濃度七氟醚其保護(hù)作用存在差異。HT22細(xì)胞經(jīng)過4 h OGD處理后致半數(shù)細(xì)胞死亡，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及MTT和PI／Hoechst結(jié)果，實(shí)驗(yàn)后續(xù)部分使用4 h OGD。

8-OHdG是活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS）攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，實(shí)驗(yàn)中常用作檢測DNA氧化損傷的標(biāo)志物。本研究中，OGD／R 4 h組中8-OHdG含量升高，其原因可能是OGD／R引起細(xì)胞DNA發(fā)生氧化損傷，而經(jīng)過1%與2%濃度七氟醚處理后，減少了細(xì)胞中的8-OHdG含量，減輕了DNA的氧化損傷，且與濃度有相關(guān)性。

為了進(jìn)一步探討七氟醚后處理減輕HT22細(xì)胞OGD／R DNA損傷及凋亡可能的分子機(jī)制，本研究在用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的同時(shí)檢測了HT22細(xì)胞中SIRT1的蛋白表達(dá)水平。Sirtuins基因缺失小鼠表現(xiàn)出基因組的穩(wěn)定性減低，表明Sirtuins蛋白家族成員在維持基因組穩(wěn)定和DNA損傷修復(fù)方面起重要作用。SIRT1可通過修飾多種底物（包括非組蛋白和組蛋白）發(fā)揮效應(yīng)，同時(shí)也可以修飾 DNA修復(fù)蛋白Ku70、PARP1和wRN，通過多個(gè)靶標(biāo)調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與CON組比較，OGD／R處理后，SIRT1和Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白BAX表達(dá)升高，而經(jīng)過1%和2%濃度七氟醚后處理后，SIRT1蛋白表達(dá)相比OGD／R組均升高，說明OGD／R可導(dǎo)致SIRT1的表達(dá)降低，凋亡級聯(lián)反應(yīng)增加，而七氟醚后處理可能通過上調(diào)SIRT1的蛋白表達(dá)，發(fā)揮DNA損傷修復(fù)作用，抑制促凋亡效應(yīng)的發(fā)生，阻止細(xì)胞向凋亡方向發(fā)展，減輕OGD／R導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，且這種保護(hù)效應(yīng)有一定的濃度依賴性。

綜上所述，七氟醚后處理可能通過上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)，減輕HT22細(xì)胞OGD／R的DNA氧化損傷及凋亡。此外，本研究只觀察了SIRT1的變化，探討了初步的分子機(jī)制，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。