異甘草素通過TLR4-TBK1-IKKε信號通路對創傷性腦損傷大鼠腦內炎癥反應的影響

王 星，余 萬，黃保勝

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）具有較高的病死率和致殘率，近年來發病率呈上升趨勢。TBI所造成的損傷主要由原發性損傷和繼發性損傷構成。由于繼發性損傷機制復雜，且持續時間長，對患者帶來的危害遠大于原發性損傷，因此針對繼發性損傷發病機制和治療措施的研究目前正處于熱點中。腦急性創傷后炎癥反應促進的炎癥因子表達，從而過表達是TBI后繼發性損傷的關鍵調控機制。因此，TBI后激發的炎癥反應可能是治療的潛在靶點。

異甘草素（isoliquiritigenin，ISL）具有廣泛的藥理活性，研究表明ISL可能通過調節腦組織炎癥因子表達，從而保護TBI大鼠神經功能。且ISL可通過抑制核轉錄因子-kappaB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）的激活改善膿毒癥小鼠的腦損傷。該研究通過大鼠TBI模型，觀察ISL對Toll樣受體4（toll-like receptor4，TLR4）-TANK結合激酶1（tankbinding kinase 1，TBK1）-IκB激酶復合物 ε（IκB kinaseε，IKKε）信號通路的影響，探討 ISL抗 TBI的作用機制，為其臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 ISL（純度HPLC≥98%）購自西安旭煌生物技術有限公司，白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6 ELISA試劑盒購自IBL公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購自 R＆D公司，一抗 TLR4、TBK1、IKKε、NF-κB購自Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）購自數譜（上海）生物科技有限公司，一抗Histone H1和 HRP標記的二抗購自 Santa Cruz公司，總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他試劑均為國產分析純；雄性SPF級SD大鼠（體質量180～220 g）購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許可證號碼：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 方法 雄性SPF級SD大鼠70只，實驗前適應環境7 d，并進行平衡木行走實驗和前爪抓握實驗訓練。剔除標準：平衡木行走實驗Feeney評分＞0分，前爪肌抓力實驗＜3分，共剔除10只。

1.2.1 TBI大鼠模型制作 按文獻方法制作TBI大鼠模型，即大鼠用10%水合氯醛麻醉后，消毒后沿頭皮正中切開，在左頂葉上方開直徑約4 mm的骨窗，保持硬膜完整，打擊裝置從30 cm高度打擊，造成大鼠左側大腦半球局部損傷，完全止血后，傷口處以碘伏清洗，并行頭皮縫合。假手術組僅開骨窗不打擊。腦損傷大鼠出現短暫的呼吸暫停四肢抽搐且昏迷2 h以上者為造模成功，未成功及死亡大鼠剔除出實驗，共剔除10只。

1.2.2 分組與給藥 造模前隨機抽取10只大鼠作為假手術組，并將上述造模成功的大鼠隨機分成4組，每組10只，即模型組和 ISL低、中、高劑量組（15、30、60 mg／kg），分組后，ISL低、中、高劑量組立即腹腔注射給藥，模型組和假手術組腹腔注射等體積的生理鹽水，以后每隔24 h給藥一次，連造模當天共給藥7次。

1.3 神經行為學觀察 末次給藥2 h后按文獻方法進行大鼠平衡木行走實驗和雙側前爪肌抓力實驗，測定其運動整合和協調能力，并進行相應的評分。

1.4 干濕比重法檢測腦含水量 末次給藥進行神經行為學觀察后，按文獻方法進行操作，測量腦含水量。腦含水量＝（濕重-干重）／濕重×100%。

1.5 ELISA法測定腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平 末次給藥進行神經行為學觀察后，10%水合氯醛麻醉，在冰臺上迅速斷頭取腦，取200 mg左右的損傷部位腦組織，按1∶9比例加入冷PBS溶液，勻漿，經冷凍離心后，取上清液，按照試劑盒說明書方法測定其TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.6 Western blot法測定腦組織中炎癥信號通路相關蛋白表達 采用RIPA裂解液提取大鼠損傷部位腦組織皮層全蛋白，用于TLR4-TBK1-IKKε信號通路相關蛋白表達分析。按照試劑盒方法提取大鼠損傷部位腦組織皮層胞質蛋白和核蛋白，用于NF-κB蛋白的表達分析。

1.7 實時熒光定量 PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）法測定腦組織中炎癥信號通路相關基因表達 按照文獻方法，采用qPCR測定損傷部位腦組織皮層中 TLR4、TBK1、IKKε和 NF-κB基因表達，以GAPDH基因作為內參，計算各基因相對表達量，引物序列見表1。

表1 qPCR法引物序列

2 結果

2.1 ISL對TBI大鼠神經行為學的影響 對于平衡木行走實驗，假手術組Feeney評分為（0.50±0.09）分，模型組大鼠 Feeney評分為（4.46±0.27）分，與假手術組比較，模型組Feeney評分上調（P＜0.001），而 ISL低［（3.57±0.30）分，P＜0.05］、中［（2.94±0.46）分，P＜0.01］、高劑量［（1.82±0.27）分，P＜0.001］均降低了TBI大鼠Feeney評分，差異有統計學意義，表明ISL改善了TBI大鼠運動整合及協調能力，見圖1A；而對于雙側前爪肌抓力實驗，模型組大鼠評分（0.86±0.15）分低于假手術組［（3.13±0.46）分，P＜0.001］，而ISL低［（1.44±0.48）分，P＜0.05］、中［（2.56±0.50）分，P＜0.01］、高劑量組［（2.92±0.34）分，P＜0.01］相對于模型組，評分增高，差異有統計學意義，表明ISL改善了TBI大鼠雙側前爪肌抓力，見圖1B。

圖1 ISL對TBI大鼠神經行為學的影響

2.2 ISL對TBI大鼠腦組織含水量和炎癥因子的影響 與假手術組［腦組織含水量：（69.01±1.57）%；腦組織 TNF-α：（2.89±0.42）pg／mg蛋白；腦組織 IL-1β：（5.11±0.74）pg／mg蛋白；腦組織 IL-6：（3.61±0.51）pg／mg蛋白］比較，模型組大鼠腦組織含水量［（80.21±2.44）%，P＜0.05］、TNF-α［（7.89±0.45）pg／mg蛋白，P＜0.001］、IL-1β［（11.91±0.63）pg／mg蛋白，P＜0.001］和 IL-6［（10.38±0.56）pg／mg蛋白，P＜0.001］水平上升，ISL可以降低TBI大鼠腦組織含水量（中、高劑量：P＜0.05）、TNF-α（低、中劑量：P＜0.01；高劑量：P＜0.001）、IL-1β（低劑量：P＜0.05；中劑量：P＜0.01；高劑量：P＜0.001）和 IL-6水平（低劑量：P＜0.01；中、高劑量：P＜0.001），差異有統計學意義，見圖2。

圖2 ISL對TBI大鼠腦組織含水量和炎癥因子水平的影響

2.3 ISL對TBI大鼠腦組織TLR 4-TBK 1-IKKε信號通路相關蛋白表達的影響 與假手術組比較，TBI大鼠腦組織 TLR4（P＜0.001）、TBK1（P＜0.01）、IKKε（P＜0.01）和 NF-κB（核蛋白）（P＜0.001）蛋白表達水平升高，而ISL低、中、高劑量組可以降低異常表達的TLR4（低劑量：P＜0.05；中劑量：P＜0.01；高劑量：P＜0.001）、TBK1（低劑量：P＜0.05；中、高劑量：P＜0.01）、IKKε（低劑量：P＜0.05；中、高劑量：P＜0.01）和 NF-κB（核蛋白）（低劑量：P＜0.05；中劑量：P＜0.01；高劑量：P＜0.001）蛋白水平，但是各組之間NF-κB（胞質蛋白）蛋白水平無明顯差異，見圖3。

圖3 ISL對TBI大鼠腦組織TLR4-TBK 1-IKKε信號通路相關蛋白表達的影響

2.4 ISL對TBI大鼠腦組織TLR4-TBK1-IKKε信號通路相關基因m RNA表達的影響 與假手術組比較，TBI大鼠腦組織腦組織 TLR4、TBK1、IKKε和NF-κBmRNA表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.001）；而 ISL可以降低 TLR4（中劑量：P＜0.05；高劑量：P＜0.01）、TBK1（低劑量：P＜0.05；中劑量：P＜0.01；高劑量：P＜0.001）、IKKε（中劑量：P＜0.05；高劑量：P＜0.001）和 NF-κB（中劑量：P＜0.05；高劑量：P＜0.01）的mRNA表達，見圖4。

圖4 ISL對TBI大鼠腦組織TLR4-TBK 1-IKKε信號通路相關基因m RNA表達的影響

3 討論

本研究表明TBI激活了大鼠腦組織中的TLR4-TBK1-IKKε信號通路，而ISL改善大鼠TBI的作用機制與抑制該信號通路有關。在本研究中，與假手術組比較，TBI大鼠神經功能評分增加，腦組織含水量、TNF-α、IL-1β和 IL-6表達升高，而 ISL改善了TBI大鼠上述生理和病理指標的異常表達，差異有統計學意義。因此上述結果表明，ISL可改善TBI大鼠腦組織中炎癥的病理變化。而本研究將深入研究ISL在此模型中腦組織保護作用是否和其調控TLR4-TBK1-IKKε信號通路有關。

既往研究表明TBI后腦組織NF-κB信號通路激活，誘導炎癥細胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）過表達，進而介導腦組織炎癥反應及繼發性損傷，從而加重病情。TLRs是模式識別受體的一種，IKK家族包括 IKKα、β、ε和 TBK1，在 κBα抑制子（inhibitor of κBα，IκBα）和 NF-κB激活中起關鍵作用。活化的TLR4通過其胞質區的Toll／IL-1受體結構域（toll／IL-1 receptor，TIR）與 TIR基域接頭分子（TIR-domain-containing adaptor-inducing interferonβ，TRIF）結合，促進 TRIF與TNF受體相關因子3（TNF receptor-associated factor 3，TRAF3）結合，TRIF-TRAF3復合物激活 TBK1和 IKKε，進而激活IκB，從而活化NF-κB等，啟動一系列特異的前炎性因子基因轉錄和表達，如促炎性細胞因子（IL-1β、TNF-α）等。而本研究發現 TBI大鼠腦組織中TLR4、TBK1、IKKε蛋白及核蛋白中 NF-κB表達水平增加，同時 TBI大鼠腦組織中 TLR4、TBK1、IKKε和NF-κBmRNA表達水平也上調，結合TBI大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的過表達，提示TLR4-TBK1-IKKε信號通路可能介導了TBI后激發的免疫炎癥反應，從而引起繼發性腦損傷。更重要的是，本研究發現ISL不但可以改善TBI大鼠的神經功能及腦組織炎癥因子的表達，還降低了TBI大鼠腦組織中 TLR4、TBK1、IKKε蛋白及核蛋白中 NF-κB的過表達，同時也降低了 TBI大鼠腦組織中 TLR4、TBK1、IKKε和 NF-κB mRNA的表達水平。且有研究表明脂多糖可以誘導TLR4活化，從而激活NF-κB的轉錄，進而誘發炎癥，而ISL可以抑制這一過程。

綜上所述，ISL的腦保護作用機制可能與其抑制TLR4-TBK1-IKKε信號通路，從而抑制下游NF-κB及炎癥因子的激活，進而改善TBI后大鼠炎性反應對腦組織的繼發性損傷有關。