羊毛固醇合成酶抑制劑RO對KCs細胞增殖的影響

劉 莉，顧亞男，周 宏，李名聰，羅 欣，張勝權

甲羥戊酸途徑是各種生命活動中關鍵的代謝途徑之一，該途徑主要與細胞內信號轉導、細胞增殖等生理活動進程相關。該途徑產生眾多的中間產物與下游產物，其中主要包括甲羥戊酸（mevalonic，MVK）、香葉焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）、法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）、羊毛固醇（lanosterol，LAN）、膽固醇（cholesterol，CH）等多種脂類物質。研究發現在甲羥戊酸途徑中關鍵酶編碼的基因突變能導致單基因遺傳疾病，并且這些疾病中的大部分都表現出了皮膚損傷。皮膚是人體抵御外界侵襲的第一道屏障，參與構成的主要是表皮，由角質形成細胞（keratinocytes，KCs）組成。有研究發現表皮是甲羥戊酸代謝途徑最活躍的場所之一。甲羥戊酸途徑作為影響生命活動的重要途徑，在細胞中受到嚴格的控制，該途徑的代謝異常可能參與癌癥、心血管系統和神經系統等疾病的發生發展。研究表明羊毛固醇合成酶抑制劑（RO 48-8071）能夠抑制乳腺癌細胞中CH的合成，從而無法形成膽固醇類固醇激素的合成前體，下調雌激素水平，抑制乳腺癌細胞增殖。此外，該實驗室前期研究指出MVK的雜合突變可導致播散型淺表性汗孔角化癥（disseminated superficial actinic porokeratosis，DSAP），這些都表明甲羥戊酸代謝途徑在皮膚生長發育和疾病轉化過程中扮演重要角色，但其具體的調控機制尚不清楚。該研究使用了羊毛固醇合成酶抑制劑RO探討甲羥戊酸途徑異常對KCs增殖的影響并探索其分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 小牛血清、MEPICF 500培養基、0.06 mol／L Nacl、Coating Matrix基質、HKGS（100×）和0.25%胰酶均購于美國Gibco公司；Dispase購于美國Sigma公司；細胞周期試劑盒購于中國上海碧云天生物公司；MTS試劑盒購于美國Promega公司；Cyclin B1、CyclinE及 β-actin均購于美國Abcam公司；二抗購于北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代皮膚角質形成細胞培養 取新鮮切除的包皮組織，生理鹽水浸泡清洗后用無血清無雙抗的DMEM培養基清洗3～5次，用無菌手術剪剪去多余皮下組織并清洗表面細菌，然后將皮膚組織剪成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，用0.4%中性蛋白酶在4℃消化過夜，期間上下顛倒1～2次，充分消化；次日用無菌鑷子分離表皮和真皮，表皮中加入0.025% 胰酶（含0.01%EDTA）置于37℃孵箱中消化5 min，用含10%胎牛血清DMEM培養基終止胰酶消化；使用200目濾網研磨過濾細胞，1 500 r／min，5 min離心，去上清液收集細胞沉淀，按照原代皮膚細胞培養要求配置MEPICF 500培養基并以5×10個／ml的細胞數接種，細胞培養瓶置于 37℃，5% CO孵箱傳代培養3代后用于本實驗研究。

1.2.2 MTS法檢測細胞增殖 消化收集在對數生長期的KCs細胞，并以細胞計數為5×10個／ml，接種于96孔板，每孔100μl細胞懸液，置于37℃，5% CO孵箱培養1 d后加入RO藥液，使終濃度為0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0、100.0μmol／L，并設對照組（0μmol／L），繼續貼壁培養3 d后加入 MTS試劑，按照試劑盒使用說明書用酶標儀檢測OD值。同上述方法接種96孔板，RO（10μmol／L）單獨或聯合 CH（40μmol／L）刺激 KCs，刺激時間分別為 1、2、3 d，對照組培養孔中加入相同濃度的PBS，培養3 d后加入MTS試劑，按照試劑盒使用說明書用酶標儀檢測OD值。根據OD值計算每組細胞存活率。

1.2.3 細胞周期檢測 消化收集在對數生長期的KCs細胞，接種于12孔板使細胞接種最終計數為5×10個／ml，置于 37℃，5% CO孵箱貼壁培養過夜，單獨加入 RO（10μmol／L）或聯合 CH（40 μmol／L）刺激 KCs，刺激時間分為 1、2、3 d，對照組培養液中加入相同濃度的PBS。3 d后胰酶消化再次收集細胞，按照周期試劑盒操作指南，用流式細胞儀檢測細胞周期。檢測數據結果用Flowjo 7.6.1分析。

1.2.4 細胞周期相關蛋白檢測 提取細胞總蛋白，并按照10μl／孔上樣量進行 SDS-PAGE分離蛋白。用10%分離膠分離電泳后，將蛋白質從分離膠中轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉膜室溫搖床封閉 2 h。1∶1 000稀釋 CyclinB1、CyclinE及 1∶5 000稀釋β-actin抗體作為一抗，4℃ 孵育過夜。TBST漂洗，1∶10 000稀釋二抗，室溫孵育 2 h。TBST漂洗，滴加化學發光液進行發光和系統成像。

2 結果

2.1 RO抑制KCs細胞增殖 RO抑制KCs細胞增殖，并呈濃度依賴性，MTS結果顯示RO藥物 IC＝10μmol／L，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。RO可呈時間依賴性抑制KCs細胞增殖，在作用3 d時，KCs細胞相對存活率最低（35%），與對照組比較差異有統計學意義（t＝54.947，P＜0.05），RO聯合CH作用KCs細胞后，CH削弱RO對KCs的增殖抑制作用，在聯合CH處理3 d KCs細胞相對存活率最低（67%），與對照組比較差異有統計學意義（t＝14.986，P＜0.05）。見圖1。

圖1 RO單獨或聯合CH刺激KCs后對細胞存活率的影響

2.2 RO對KCs細胞周期的影響 當RO藥物濃度（10μmol／L）一定時，隨著作用時間的增加，KCs細胞周期中的G1期細胞比例上升，在1、2、3 d實驗組G1期 DNA平均含量為63.19%、71.54%和83.16%，與對照組（54.89%）比較差異有統計學意義（F＝55.9，P＜0.05）。S期呈現下降的趨勢，在1、2、3 d實驗組細胞 S期 DNA平均含量為25.59%、20.43% 和 9.11%，與對照組（35.28%）比較差異有統計學意義（F＝6.635，P＜0.05）；G2期細胞比例沒有明顯變化。RO聯合CH處理KCs細胞后，KCs細胞周期中的G1期細胞比例緩慢上升，S期隨著作用時間的增加呈現緩慢下降的趨勢，而G2期細胞比例沒有顯著變化。見圖2。

圖2 RO單獨或聯合CH對KCs細胞周期的影響

2.3 周期蛋白表達 蛋白質凝膠電泳結果顯示RO單獨處理KCs的細胞內CyclinB1、CyclinE蛋白的表達受到明顯抑制作用，RO聯合CH處理KCs細胞后，RO對CyclinE抑制表達作用減弱，在聯合CH處理2 d最顯著（P＜0.05）；但CH對CyclinB1水平的降低沒有顯著影響。見圖3。

圖3 Western blot分析周期蛋白表達

3 討論

甲羥戊酸途徑是機體重要的代謝活動之一，能夠為細胞提供多種營養活性分子。皮膚是人體最大的器官，該器官功能的正常與甲羥戊酸代謝途徑順利進行息息相關。有研究表明，甲羥戊酸途徑中的法尼斯基二磷酸合成酶抑制劑（帕米膦酸鹽）可誘導細胞人口腔角質形成細胞衰老和p63的表達，并抑制KCs增殖。HMG-CoA還原酶抑制劑（他汀類、二磷酸鹽如唑來膦酸及胺丁羥磷酸鹽）能通過改變細胞周期相關蛋白表達從而抑制原代角質形成細胞增殖。在本研究中當RO單獨作用于KCs細胞后，細胞周期的G1期阻滯，抑制細胞增殖，并且細胞周期蛋白CyclinB1、CyclinE的表達隨著作用時間的增加而減少。前期研究發現法尼基轉移酶作用KCs后，導致 KCs中MVA累積，CH合成減少，KCs增殖抑制；本研究發現當RO與CH聯合作用于KCs后，CH可部分削弱RO對KCs的增殖抑制作用，該結果表明 RO可能通過減少下游CH的合成，進而導致KCs細胞基因水平的改變，影響細胞增殖。因此，KCs的增殖是一個是由許多分子調節的復雜過程。本研究的結果部分解釋了甲羥戊酸途徑功能障礙所致的KCs增殖抑制機制。

綜上所述，RO引起KCs甲羥戊酸途徑代謝紊亂，KCs細胞周期和周期蛋白發生了變化，并抑制KCs的增殖。因此，有效地調節甲羥戊酸途徑順利進行對KCs的增殖至關重要。為研究汗孔角化癥等皮膚疾病發病機制提供了一定的理論基礎。