miR-34b-5p上調抑制彌漫大B細胞淋巴瘤的侵襲及RhoA／ROCK信號通路

李敬東，韓效林，楊 翠，高攀科，陳小雙，梁勇會

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是一種高度異質性的惡性淋巴瘤。治療DLBCL的標準方案是每21天進行1次利妥昔單抗、潑尼松、阿霉素、長春新堿和環磷酰胺的化學免疫療法（rituximab，prednisone，doxorubicin，vincristine and cyclophosphamide，R-CHOP）。根據國際預后指數（international prognostic index，IPI）判斷預后，對于IPI風險評分低級的患者，R-CHOP的治愈率超過80%，但在IPI風險評分高和中級的患者中，預后仍不理想。同時由于耐藥性的快速出現，導致有30% ～40%的患者復發。先前研究表明，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）能夠參與調節癌細胞的惡性生物學行為。已經確定miR-34是關鍵的抑癌基因，其靶基因參與了耐藥機制的形成，同時耐藥癌細胞中低水平的miR-34被升高，化療藥物的敏感性被恢復。并且研究表明在甲狀腺癌、乳腺癌和炎癥相關腸癌中 miR-34b-5p表達量均下降。該研究主要檢測miR-34b-5p過表達是否對SU-DHL-4細胞增殖、侵襲、凋亡及RhoA／ROCK信號通路有影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與處理 DLBCL SU-DHL-4細胞購自中國科學院的細胞庫，并用含10%胎牛血清的Dulbecco改良的 Eagle培養基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）進行培養于37℃生長。miR-34b-5p mimic和mimic-NC根據制造商的說明，使用Lipofectamine 2000試劑（美國Invitrogen公司）轉染到SU-DHL-4細胞。

1.2 總RNA提取、反轉錄和熒光定量 使用TRIzol從SU-DHL-4細胞提取總RNA，提取的總RNA首先去除基因組中的DNA，然后進行反轉錄，以上步驟按照產品說明書進行操作。熒光定量檢測反應體系：5μl的SYBR Premix，各0.5μl的上游引物和下游引物，3μl的 RNase Free dHO，1μl的 cDNA。程序：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。擴增完成后進行溶解曲線分析：95℃維持10 s，65℃處理1 s，此后從65℃開始，每1個循環溫度增加0.5℃，時間為1 s。

1.3 菌落形成實驗 將SU-DHL-4細胞轉染miR-34b-5pmimic和miR-NC進行處理，在無毒培養基中培養大約14 d。用冷的甲醇-冰醋酸固定細胞，并用結晶紫染色。

1.4 流式細胞術 流式細胞儀檢測SU-DHL-4細胞凋亡，采用 Annexin v-熒光素（Annexin v-luciferin，AV）和碘化丙啶（propidiuMIodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（美國Invitrogen公司）流式細胞術檢測不同處理SU-DHL-4細胞的凋亡率。刺激后，用PBS洗滌細胞，Annexin V-FITC和PI在室溫黑暗中孵育15 min。流式細胞術使用FACScan流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）進行流式分析，數據使用FlowJo軟件（美國Ashland公司）進行分析。

1.5 Western blot SU-DHL-4細胞處理后，將細胞用裂解緩沖液裂解在4℃并以14 000 r／min離心15 min。蛋白質濃度由BCA蛋白定量檢測盒（中國上海碧云天生物有限公司）測量。取20μg總蛋白在12%SDS-PAGE并轉移至PVDF膜。將膜在37℃下用1 h封閉5%的牛血清白蛋白，然后與抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、RhoA和 ROCK在 4℃過夜。用TTBS洗滌后緩沖液（含Tween-20的Tris緩沖鹽水），加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（二抗）37℃反應1 h；洗膜后ECL曝光成像并應用quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 Transwall實驗 用不含血清的DMEM將接種5×10／200μl SU-DHL-4細胞在 transwell室上部。下腔室充滿500μl10%FBSDMEM。孵育24 h后，將下腔室中的細胞固定在95%乙醇中，然后用蘇木精染色。在倒置顯微鏡下計算細胞的侵襲數量。

2 結果

2.1 miR-34b-5p過表達對DLBCL SU-DHL-4細胞增殖的影響 SU-DHL-4細胞分別轉染mimic-NC和 miR-34b-5p mimic，RT-qPCR檢測 miR-34b-5p mRNA的表達量。結果表明，轉染miR-34b-5p組中miR-34b-5p的表達量上調［（0.99±0.06）vs（65.13±11.31）］，差異有統計學意義（t＝9.474，P＜0.01）。菌落形成實驗結果表明，miR-34b-5p的過表達能抑制 SU-DHL-4細胞的增殖［（55.74±9.12）%vs（11.42±6.19）%］，差異有統計學意義（t＝10.273，P＜0.01）。見圖1。提示 miR-34b-5p過表達能抑制DLBCL SU-DHL-4細胞增殖。

圖1 菌落形成實驗檢測SU-DHL-4細胞增殖

2.2 miR-34b-5p過表達對DLBCL SU-DHL-4細胞凋亡的影響 通過流式細胞術檢測細胞的凋亡，結果表明在細胞轉染miR-34b-5p組中細胞凋亡率上調［（4.91±1.71）%vs（28.80±4.52）%］，差異有統計學意義（t＝9.860，P＜0.01）。通過Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的含量，結果表明Bax／Bcl-2的比值在細胞轉染miR-34b-5p組中上調［（0.04±0.02）vs（5.82±0.61）］，差異有統計學意義（t＝8.387，P＜0.01）。見圖2。提示miR-34b-5p過表達能夠促進DLBCL SU-DHL-4細胞凋亡。

圖2 細胞凋亡檢測

2.3 miR-34b-5p過表達對DLBCL SU-DHL-4細胞侵襲的影響 通過Transwell檢測細胞侵襲力，結果表明在細胞轉染miR-34b-5p組中細胞侵襲下調［（43.74±8.55）vs（9.19±6.01）］，差異有統計學意義（t＝6.503，P＜0.01）。見圖3。提示miR-34b-5p過表達對抑制DLBCL SU-DHL-4細胞侵襲。

圖3 Transwell試驗

2.4 miR-34b-5p過表達對E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達的影響 miR-34b-5p過表達時E-cadherin基因的蛋白表達水平升高［（0.05±0.02）vs（0.54±0.09）］，差異有統計學意義（t＝4.935，P＜0.05），而N-cadherin和Vimentin基因的蛋白表達水平下降［N-cadherin：（0.32±0.07）vs（0.06±0.04）；Vimentin：（0.41±0.08）vs（0.04±0.02）］，差異有統計學意義（N-cadherin：t＝4.851，P＜0.05；Vimentin：t＝9.236，P＜0.05）。見圖 4。提示miR-34b-5p過表達能夠抑制DLBCL SU-DHL-4細胞侵襲。

圖4 膜蛋白測定

2.5 miR-34b-5p過表達對RhoA／ROCK信號通路的影響 結果表明miR-34b-5p過表達時RhoA和ROCK蛋白的表達水平下降［RhoA：（0.88±0.09）vs（0.03±0.01）；ROCK：（0.93±0.13）vs（0.07±0.04）］，差異有統計學意義（RhoA：t＝11.091，P＜0.05；ROCK：t＝28.622，P＜0.05）。見圖5。提示miR-34b-5p過表達能夠抑制RhoA／ROCK信號通路。

圖5 RhoA和ROCK信號蛋白測定

3 討論

DLBCL是一種惡性淋巴瘤，影響所有年齡段的患者，臨床表現廣泛。R-CHOP治療方案在治療DLBCL上取得一定的成果，但同時也出現一些棘手的問題，比如耐藥性產生導致預后不良、嚴重病患治愈率差等。目前，miRNA在診斷和治療DLBCL扮演著很重要的角色。研究表明miR-214過表達可通過靶向目的基因PD-L1抑制OCI-Ly3細胞活力和侵襲性并誘導細胞凋亡，從而抑制DLBCL的進展。同時，miR-214通過調節 IL-10、IFN-γ和 TNF-α的表達，靶向目的基因PD-L1來調節DLBCL的免疫反應。最重要是研究表明miR-34b基因甲基化可能導致該基因轉錄表達沉默，是DLBCL發生發展的促進因素。本研究通過在SU-DHL-4細胞轉染miR-34b-5p，結果表明miR-34b-5p的過表達能抑制SU-DHL-4細胞的增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡，從而抑制DLBCL的發展進程。

E-cadherin是calcium-dependent跨膜糖蛋白，位于上皮組織，是細胞黏附分子和信號轉導因子的組成部分，可以直接與蛋白復合物或與肌動蛋白細胞骨架結合形成β-連環蛋白，從而預防和減少腫瘤細胞黏附。N-cadherin也是cadherin家族中重要的組成部分。Vimentin也是一種細胞骨架蛋白，在正常的上皮細胞中不表達，但廣泛分布于成纖維細胞、內皮細胞和間質細胞的淋巴細胞中。研究發現，Vimentin在多種上皮性腫瘤中存在異常表達，并與癌細胞的分化、侵襲和轉移密切相關。本研究結果表明miR-34b-5p過表達導致E-cadherin基因和蛋白的表達水平升高，而N-cadherin和Vimentin基因的蛋白的表達水平下降。miR-34b-5p過表達可抑制SU-DHL-4細胞分化、侵襲和轉移。

ROCK是GTPase蛋白RhoA的下游效應子。ROCK家族是由ROCK1和ROCK2組成的，在肌動蛋白細胞骨架的組織中起著核心作用，并參與多種基本的細胞功能，例如收縮、黏附、遷移、增殖和凋亡等。Rho／ROCK信號通路在癌癥侵襲和轉移中起著關鍵作用。已知Rho家族的GTPase蛋白可以重組細胞骨架并通過激活ROCK從而調節細胞遷移。研究表明，運用溶血磷脂酸協同激活Rho／ROCK信號通路從而刺激卵巢癌發展進程。本研究結果表明miR-34b-5p過表達時RhoA和ROCK蛋白的表達水平下降，說明該通路未被激活，從而減輕SU-DHL-4細胞的侵襲力。

綜上所述，本研究發現miR-34b-5p過表達抑制SU-DHL-4細胞增殖、侵襲并誘導細胞凋亡，同時抑制RhoA／ROCK信號通路。因此，miR-34b-5p有望成為治療DLBCL的新靶點。本研究僅為體外細胞試驗和機制的初步探討，體內試驗有待進一步深入研究。