遲緩埃格特菌的MALDI-TOF MS和16S rRNA鑒定及生物學特征研究

李祥云，王中新，朱幫強，潘亞萍，周寅第，胡媛媛，宋國濱，徐元宏

遲緩埃格特菌是一種專性厭氧革蘭陽性桿菌，生長緩慢，5 d內可形成肉眼可見菌落，1935年科學家埃格特首次從人類糞便中分離出該菌，最初歸類在厭氧桿菌屬中，1999年完成測序后細分為埃格特屬。該菌主要存在于消化道內，也是闌尾炎、肝膿腫和皮膚膿腫的病原菌，但原發疾病后進入血液，形成菌血癥，卻很罕見。血培養厭氧菌陽性在臨床以脆弱擬桿菌和艱難梭狀芽孢桿菌多見，遲緩埃格特菌陽性的菌血癥較為少見，2014年韓國才報道該國首例遲緩埃格特菌引起的菌血癥。安徽醫科大學第一附屬醫院近3年的血培養厭氧陽性菌中，僅有2例此菌的鑒定。另外，遲緩埃格特菌導致的菌血癥病死率較高，達到22%～43%，應引起足夠的重視。該文對2例血培養陽性標本進行細菌培養和分離，進行遲緩埃格特菌的鑒定和藥敏研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科2020年1月和4月血厭氧培養陽性鑒定出的兩株遲緩埃格特菌。

1.1.2 試劑與儀器 瓊脂粉（江門市凱林貿易有限公司），基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）質譜儀（法國生物梅里埃公司），引物（合成）購自上海生工生物公司，DNA marker和Premix Taq Ⅲ（日本TaKaRa公司），Vitek MSCHCA基質液（法國生物梅里埃公司），PCR儀（ABI9700型），紫外線凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 常規細菌培養 當天報告陽性的厭氧血培養瓶，取1滴接種于血平板、麥康凱平板和巧克力平板上，加入厭氧包在37℃和5% CO箱厭氧培養72 h后，取菌落進行革蘭染色鏡檢，觸酶實驗。

1.2.2 MALDI-TOF MS鑒定 挑取純菌落，加入70%甲酸10μl，渦旋振蕩，取1μl標本涂于靶板，加入0.5μl基質液，待完全干燥后，使用法國生物梅里埃公司的MALDI-TOF MS儀進行鑒定，再將質譜圖與標準數據庫中的質譜圖進行匹配。

1.2.3 16S rRNA基因檢測 將原始菌分純擴大培養后提取原始菌基因組DNA。正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和反向引物 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3′） 進行16S rRNA基因PCR擴增實驗。反應程序如下：96℃3 min、96℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min，此條件下35個循環、72℃10 min，PCR反應結束后，1%的瓊脂糖鑒定并使用凝膠回收試劑盒回收所需PCR產物片段。試劑盒、引物及測序服務均由合肥通用生物科技有限公司完成。測序后與GeneBank數據庫中已知菌的16S rRNA基因進行比對。將測序結果采用MEGA7.0版本軟件建立系統發育樹。

1.2.4 藥敏結果判讀及解釋 根據2019年美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）文件進行藥敏結果判讀及解釋。

2 結果

2.1 臨床資料 ①患者男，55歲，因1月余頭暈嘔吐入院，顱內占位病變（淋巴瘤待排），在術前準備中，血象和血糖出現危急值，體溫最高達到38.7℃；②患者男，56歲，因右大腿近端破潰伴發熱1周余入院，患者曾第12胸椎骨折手術治療后長期臥床及輪椅，因護理不佳，右大腿近端皮膚出現紅腫破潰伴發熱，體溫最高達到40.4℃。兩例患者均需氧瓶和厭氧瓶雙側雙瓶血培養，厭氧瓶報陽時間分別為70.0 h和70.7 h。

2.2 細菌培養 分純培養72 h，肉眼可見直徑0.25～0.75 mm的灰白色、半透明或透明、光滑、輕微凸起的菌落，無溶血環（圖1），革蘭染色為陽性桿菌（圖2），觸酶試驗陽性。

圖1 分離菌株分純培養72 h后結果

圖2 分離菌株革蘭染色陽性 SP×1 000

2.3 細菌鑒定 分離菌株的MALDI-TOF質譜圖與數據庫中已有的遲緩埃格特菌吻合度最高，鑒定為遲緩埃格特菌，置信度為99.9%（圖3）。菌落的基因組DNA PCR產物約為1 400 bp（圖4），測序后與已知遲緩埃格特菌的16S rRNA基因相似性為100%，部分堿基序列圖譜如圖5所示。使用MEGA7軟件構建分離菌的系統進化樹，發現分離菌株與遲緩埃格特菌位于同一分支（圖6），鑒定為遲緩埃格特菌，登錄號是NR 074377.1。

圖3 分離菌株質譜圖

圖4 分離菌株16S rRNA基因擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

圖5 分離菌株的16S rRNA gene部分堿基序列圖譜

圖6 分離菌株的系統發育樹

2.4 藥敏試驗 該菌對青霉素、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林-舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、甲硝唑和克林霉素均敏感，最小抑菌濃度（minimuMInhibitory concentration，MIC）見表1。

表1 分離菌株的藥敏結果

2.5 診斷與治療 ①診斷為顱內占位病變（淋巴瘤待排）、肺部感染和腦梗死。治療上脫水降顱內壓、激素沖擊及抑酸護胃，美羅培南抗感染，治療11d后，經患者和家屬要求出院；② 診斷為受壓區壓瘡伴感染、發熱和截癱。治療上補液，美羅培南抗感染，創面清創換藥等處理，并實施慢性潰瘍修復和創面密封負壓引流術，術后抗生素改為頭孢哌酮-舒巴坦。治療17 d后，患處壓瘡壞死組織已大部清除，無明顯滲出物，部分新鮮肉芽組織形成，應患者要求出院。出院后繼續定期換藥，控制感染。

3 討論

傳統細菌鑒定大多依靠生化反應及血清學檢測等，耗時長且準確性差，全自動細菌鑒定分析儀雖能克服這些缺點，但鑒定的細菌種類有限。近年來，MALDI-TOF MS廣泛應用于臨床實驗室細菌和真菌鑒定，具有高達90%以上的鑒定準確率，過程簡單快速，且由于數據庫的不斷完善，給一些臨床罕見菌的鑒定也提供了方便。本研究中使用MALDITOF MS鑒定出分離菌株是遲緩埃格特菌，置信度為99.9%。同時，通過擴增分離菌株的16S rRNA，鑒定結果和 MALDI-TOF MS結果一致。16S rRNA測序技術是最常用的高通量測序組學技術之一，16S rRNA廣泛存在于原核生物的細胞中，保留了大量的信息量便于擴增和測序，利用恒定區序列的引物將16S rRNA基因序列擴增出來，可再利用可變區序列的差異對不同屬和不同種的細菌進行分類鑒定。16S rRNA基因分析可以快速準確的進行種屬鑒定，確定微生物在進化中的位置。根據測序結果進行同源比對構建出系統發育樹，確定各個菌種之間的親緣關系。