中國西部不同地區(qū)泡球蚴對小鼠的感染性研究

楊晨晨，馬 磊，吳熙然，李志強(qiáng)，壽 璽，張 春，魏 琴，姜 濤

包蟲病分為囊型包蟲病（cystic echinococcosis，CE）和泡型包蟲病（alevolar echinococcosis，AE）兩種。AE是由多方棘球絳蟲（Echinococcosis multicocularis，E.multicocularis）的幼蟲（泡球蚴）寄生于人體所致的一種致死性寄生蟲病，又稱為泡球蚴病，該病幾乎原發(fā)于肝臟。研究發(fā)現(xiàn)，其病灶緩慢生長，類似于緩慢進(jìn)展的惡性腫瘤，所以該病有“蟲癌”之稱。在中國，第一批人類病例是在20世紀(jì)60年代從西部地區(qū)報(bào)道的，AE在中國的流行地區(qū)主要集中于新疆維吾爾自治區(qū)西北地區(qū)、青藏高原東部地區(qū)、寧夏南部及甘肅中南部等。不同屬地的泡球蚴對人類及家畜感染率有很大差異，通過對不同屬地泡球蚴對癥治療，可進(jìn)一步為治療干預(yù)泡球蚴病提供依據(jù)。該研究擬對新疆、青海、四川三地來源的泡球蚴對宿主肝臟的感染性作比較，分析不同地區(qū)泡球蚴的感染特點(diǎn)，為不同地區(qū)的AE臨床治療提供思路和方向。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備 手術(shù)器械（手術(shù)刀、手術(shù)剪、粗剪刀、手術(shù)鑷、血管鉗等）購自北京銘成嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司，超凈臺（蘇州凈化有限責(zé)任公司，SW-CJ-2F），石蠟切片機(jī)（德國 Leica），倒置顯微鏡（日本 Olympus公司），冷凍離心機(jī)（Eppendorf），生化儀（BS-120，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），血球儀（BC-5000vet，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

1.2 主要試劑 0.1%伊紅、蘇木精購自北京中杉金橋生物試劑有限公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海生物工程有限責(zé)任公司，二甲苯購自福晨化學(xué)試劑有限公司，胃蛋白酶購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate amino transferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒、血球試劑包購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組 40只BALB／c小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2018-0001，動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003。按泡球蚴來源地的不同，將BALB／c小鼠分為4組：對照組（10只）、EM-1組（青海株，10只）、EM-2組（新疆株，10只）和EM-3組（四川株，10只），感染期為6個(gè)月，實(shí)驗(yàn)獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過，倫理審批號：IACUC20170706-01，實(shí)驗(yàn)動物在新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)，遵循3R原則統(tǒng)一管理。

1.4 泡球蚴腹腔感染模型的建立 將新疆、青海、四川地區(qū)的長爪沙鼠種鼠，頸椎脫臼后處死，在無菌條件下解剖，打開腹腔，取出腹腔的泡球蚴組織，在操作過程中盡量避免剪碎泡狀組織造成污染，收集腹腔中光滑、成簇生長及附著于腹壁、腸系膜、肝臟表面的新鮮泡球蚴組織，置于倒有適量抗生素生理鹽水的培養(yǎng)皿中，剔除組織塊表面組織，用PBS清洗3～5遍，研磨，80目尼龍篩過濾制成勻漿，收集勻漿倒入離心管中，用PBS液反復(fù)清洗，直至分為三層，取中層添加PBS吹打數(shù)次，靜置數(shù)分鐘，重復(fù)此步驟3次后，將收集的原頭蚴合并，加入終濃度為1%的胃蛋白酶（pH 2.0）于37℃消化15～30 min。加生理鹽水用巴士管充分吹打液體，抽取10μl混懸液，用10μl 0.4%臺盼藍(lán)染色，計(jì)算活力。將所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行腹腔注射，對照組腹腔注射1 ml生理鹽水。其余3組用生理鹽水制成不同來源地的泡球蚴原頭節(jié)，原頭蚴稀釋至2 000個(gè)／ml，將1 ml混懸液接種于BALB／c小鼠制備泡球蚴動物模型。

1.5 血常規(guī)、血生化檢測 分別于感染后7 d，1、3、6個(gè)月采用小鼠眼內(nèi)眥靜脈取血，全血以3 000 r／min離心5 min，取血清，采用生化分析儀測定血清中ALT、AST、ALP含量，全血細(xì)胞儀測定全血中白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）及血小板（platelet，PLT）、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophilic granulocyte，EOS）的含量。

1.6 肝臟組織標(biāo)本取材及蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色 6個(gè)月時(shí)，采血后麻醉小鼠，采用頸椎脫臼法處死，取其肝臟組織及感染的包囊，標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，取出進(jìn)行石蠟包埋，3μm切片，進(jìn)行HE染色，在100倍視野下，計(jì)數(shù)原頭蚴個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組BALB／c小鼠在不同時(shí)期血常規(guī)的比較 采用重復(fù)測量方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對血常規(guī)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，項(xiàng)目包括 WBC、RBC、EOS、PLT，球型檢驗(yàn)P＜0.05，不服從球形檢驗(yàn)，參看多變量檢驗(yàn)結(jié)果，對于因子，在不同的時(shí)間 WBC、RBC、EOS、PLT改變不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明各組在7 d，1、3及 6個(gè)月 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 WBC、RBC、EOS、PLT不同。對于因子和分組，4組對應(yīng)的P＜0.05，表明4組間 WBC、RBC、EOS、PLT也不同。進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩比較，再進(jìn)行兩兩比較通過Bonferroni法進(jìn)行校正，與對照組比較，EM-1組、EM-2組、EM-3組WBC、EOS差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），RBC、PLT組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組數(shù)據(jù)比較采用one-way AVONA檢驗(yàn)，在感染6個(gè)月時(shí)，EM-1組、EM-2組、EM-3組WBC高于對照組（P＜0.05），在感染3個(gè)月時(shí)，與對照組比較，EM-1組、EM-2組、EM-3組EOS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），3、6個(gè)月時(shí) PLT與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 各時(shí)間點(diǎn)各組BALB／c小鼠血常規(guī)

2.2 各組BALB／c小鼠在不同時(shí)期肝功能的比較 4組間AST、ALP水平不同。進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩比較，再進(jìn)行兩兩比較通過Bonferroni法進(jìn)行校正，與對照組比較，EM-1組、EM-2組、EM-3組AST、ALP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組數(shù)據(jù)比較采用one-way AVONA檢驗(yàn)，在感染1、3、6個(gè)月時(shí)，EM-1組、EM-2組、EM-3組 AST高于對照組（P＜0.05），感染 6個(gè)月時(shí)，EM-2組、EM-3組 ALT高于對照組（P＜0.05），在感染1、3、6個(gè)月時(shí)，EM-1、EM-2、EM-3組ALP明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2，表1。

表1 各組小鼠在不同時(shí)間段肝功能指標(biāo)值比較

圖2 各組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)肝功能的比較

2.3 各組BALB／c小鼠存活情況及包囊感染情況 6個(gè)月終止實(shí)驗(yàn)時(shí)，對照組均存活，EM-1、EM-2、EM-3組小鼠均發(fā)現(xiàn)有死亡，未發(fā)生感染的小鼠。各組小鼠包囊感染只數(shù)見表2。其中EM-2組小鼠感染率最高，達(dá) 77.8%，EM-3感染率最低，僅為62.5%。

表2 各組小鼠感染情況

小鼠腹部亦明顯增大，麻醉后打開小鼠腹腔，EM-1組、EM-2組、EM-3組均可見大小不等囊泡，分布于腹腔，泡球蚴呈大小不等的菜花樣，類似腫瘤的一些團(tuán)塊樣病灶組織，表面可見血管生成。部分BALB／c小鼠在脾臟表面也有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的泡球蚴組織。從大體觀察，3組小鼠囊泡未見明顯差異，見圖3。

圖3 小鼠泡球蚴感染模型的大體觀察

2.4 腹腔感染后各組小鼠體質(zhì)量的變化 實(shí)驗(yàn)6個(gè)月，對各株感染的BALB／c小鼠進(jìn)行稱重，感染后體質(zhì)量明顯高于感染前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對照組實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量沒有明顯變化。組間比較，EM-1組、EM-2組和EM-3組間體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝51.699，P＜0.001），體質(zhì)量均高于對照組，但EM-1組、EM-2組和EM-3組3組間體重量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 感染前和感染6個(gè)月各組BALB／c小鼠體質(zhì)量的變化

2.5 各組BALB／c小鼠包囊產(chǎn)生原頭蚴的數(shù)量通過小鼠包囊進(jìn)行HE染色，可觀察到大量原頭蚴，在100倍視野下，選擇5個(gè)視野，對包囊內(nèi)原頭蚴數(shù)量進(jìn)行觀察，EM-1組、EM-2組、EM-3組產(chǎn)生包囊數(shù)量分別為（150±36.06）、（220±33.47）、（78±16.43）個(gè)，3組經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝28.550，P＜0.001），兩兩比較，EM-2組原頭蚴數(shù)量高于EM-1組、EM-3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 組織病理學(xué)觀察 各組小鼠肝臟組織經(jīng)HE染色后，對照組肝臟組織呈正常狀態(tài)，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，邊界清晰（圖5A、A1）；實(shí)驗(yàn)各組的肝組織低倍鏡下可見散在的大小不等的囊泡，囊泡外圍可見大量炎性細(xì)胞增生（EOS、淋巴細(xì)胞等，以淋巴細(xì)胞居多），囊泡壁伴有新生肉芽組織形成及纖維組織增生（圖5B、C、D），尤其以新疆株感染小鼠肝細(xì)胞壞死最為明顯，可見泡狀蚴囊泡體積較大，肝臟壞死損傷面積大，炎性細(xì)胞浸潤，沒有完整的肝小葉，囊泡中央已經(jīng)充滿原頭蚴和囊液，囊泡壁外周的肝細(xì)胞較正常變小，核增大，部分肝細(xì)胞有異型增生改變（圖5B、B1）。青海株的肝臟低倍鏡下可見散在分布的大小不等的泡狀蚴囊泡及數(shù)量不等的炎性細(xì)胞增生（圖5C），高倍鏡下可見囊泡壁伴有新生肉芽組織形成及纖維組織增生，可見淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞等呈竇性浸潤生長（圖5C1）。四川株的肝臟低倍鏡下也可見散在分布的大小不等的泡狀蚴囊泡及數(shù)量不等的炎性細(xì)胞增生（圖5D），但數(shù)量遠(yuǎn)不及前兩組，損傷范圍也較少；高倍鏡下可見肝細(xì)胞臟結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，肝門靜脈周圍有炎性細(xì)胞增生，增生的細(xì)胞以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主，增生的細(xì)胞和纖維組織已經(jīng)完全破壞了肝臟結(jié)構(gòu)（圖 5D1）。

圖5 接種6個(gè)月肝臟組織HE染色

在100倍視野下觀察肝臟中原頭蚴個(gè)數(shù)，EM-2組的原頭蚴數(shù)量最多，EM-3組的原頭蚴數(shù)量最少，結(jié)果與“2.5”項(xiàng)下包囊中原頭蚴個(gè)數(shù)觀察的感染情況一致，經(jīng)單因素方差分析顯示，EM-1組、EM-2組EM-3組三組原頭蚴數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝27.246，P＜0.001），經(jīng)兩兩比較，EM-2組原頭蚴數(shù)量最多，高于EM-3組和EM-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三組產(chǎn)生原頭蚴數(shù)量的比較見圖6。

圖6 腹腔感染后各組原頭蚴數(shù)量

3 討論

AE和CE是包蟲病的兩個(gè)類型，AE在肝臟內(nèi)浸潤性生長，可產(chǎn)生惡性腫瘤樣發(fā)展和致命后果；CE呈多囊性外觀，形成具有壞死區(qū)域的浸潤性病變。Kern et al報(bào)道，與 AE相關(guān)的臨床表現(xiàn)類似于“惡性表現(xiàn)”，是一種無聲進(jìn)展的肝臟疾病，并伴有局部組織浸潤和轉(zhuǎn)移。研究泡球蚴感染過程中的主要病理變化及動態(tài)過程，可為泡球蚴的致病機(jī)制和治療提供線索。

泡球蚴對人類及家畜的感染率存在地區(qū)差異。泡球蚴病在中國主要流行于新疆、甘肅、寧夏、青海、四川等省區(qū)。西藏地區(qū)AE的感染率為0.18%。2016年西藏自治區(qū)包蟲病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)顯示，人群發(fā)病率為1.66%，推測西藏全區(qū)大約有5萬患者；青海省人群棘球蚴病感染率為 0.18% ～8.23%；新疆AE高危人群數(shù)量達(dá)580萬，暴露人群感染率約為0.2%。推測不同地區(qū)人群感染率差異可能與棘球蚴致病性有關(guān)。有關(guān)中國各地泡球蚴致病機(jī)制和致病特點(diǎn)尚不清楚。

李新蘭等發(fā)現(xiàn)中國3個(gè)地區(qū)多房棘球絳蟲在蛋白成分、抗原性及抗原分布上的不同。但查閱文獻(xiàn)，少有不同來源地泡球蚴對宿主肝損傷的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。本研究擬建立3株不同源地（新疆株、四川株和青海株）泡球蚴在BALB／c小鼠中穩(wěn)定傳代保種動物模型，分析不同來源地泡球感染BALB／c小鼠后存在致病性的差異性和病理特征。

本研究使用不同來源地的泡球蚴，經(jīng)腹腔接種實(shí)驗(yàn)小鼠，7 d、1、3、6個(gè)月時(shí)進(jìn)行血常規(guī)和血生化的檢測。AST、ALT、ALP是衡量肝臟損傷的發(fā)生指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，在感染 6個(gè)月時(shí)，EM-1、EM-2、EM-3組小鼠AST和ALT、ALP均高于對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示小鼠發(fā)生了造模后的嚴(yán)重肝臟損傷。但是對各組感染小鼠進(jìn)行比較，血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)和肝功能指標(biāo)在各個(gè)時(shí)間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示雖然來自不同地域，感染不同來源地的泡球蚴對宿主血常規(guī)和肝功能指標(biāo)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究通過腹腔注射發(fā)現(xiàn)，3株泡球蚴接種后，泡球蚴形態(tài)相似，較透明。從發(fā)生肝臟感染的個(gè)數(shù)觀察，EM-2組感染率最高，EM-3組感染率最低。從肝臟HE染色結(jié)果顯示，EM-2組原頭蚴的數(shù)量普遍高于另外兩組。不同來源泡球蚴株的感染性存在一定的差異，以新疆株的感染性最強(qiáng)感染，四川株感染最弱，在建立不同來源地動物模型感染時(shí)，根據(jù)感染強(qiáng)弱的不同。可以根據(jù)需要建立不同的模型。

另外，本研究建立了不同來源地泡球蚴的感染模型，而接種時(shí)間和數(shù)量的不同，小鼠建立的泡球蚴動物模型特征也會不同，原頭節(jié)接種太少，動物能夠感染但不易感染；接種量太大，容易導(dǎo)致動物因感染過度而引起死亡，所以在原頭節(jié)接種量的研究上，多數(shù)試驗(yàn)的接種原頭節(jié)數(shù)為1 800～2 000個(gè)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還可將對3株不同來源地泡球蚴模型探討注射時(shí)間、接種途徑對泡球蚴感染的模型影響的進(jìn)一步研究，為研究其致病性的特點(diǎn)和發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

徐藝玫等用多房棘球蚴對灰倉鼠進(jìn)行腹腔接種，外觀肉眼觀察有棘球蚴包囊生長、顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)有原頭節(jié)生長。廖力夫 等嘗試用腹膜穿刺肝臟接種的方法接種灰倉鼠，結(jié)果接種的17只有8只腹腔出現(xiàn)包囊，表明接種時(shí)接種液從接種孔被擠出，肝臟成功接種只有5只，另有心臟和肺臟分別感染1只和3只，可能是原頭節(jié)隨血流到心臟和肺臟。王慧 等建立了穩(wěn)定的棘球蚴感染BALB／c小鼠動物模型，接種多房棘球絳蟲微囊的小鼠感染模型中，小鼠腹腔中的包蟲囊則不是游離的單囊組織，而是類似腫瘤組織狀的大的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，團(tuán)塊組織上附有豐富的血管生成，與臨床表現(xiàn)相吻合，本研究結(jié)果與其一致，成功建立了泡球蚴感染的小鼠模型。

但是通過對三地來源的蟲株間進(jìn)行比較，對小鼠的感染率不同，以新疆株感染性最強(qiáng)，提示蟲株存在種內(nèi)的毒力和致病性差異，以及對宿主的易感性差異。目前多數(shù)研究主要集中在實(shí)驗(yàn)動物的選擇上，文獻(xiàn)中報(bào)道較多的實(shí)驗(yàn)動物為老鼠。國內(nèi)外有不少的研究者選用鼠建立了不同的AE動物模型，比如倉鼠、棉鼠、昆明小鼠、新疆塔城地區(qū)和布克塞爾縣的赤頰黃鼠。另外從動物模型建立的方法和途徑即原發(fā)感染、繼發(fā)感染進(jìn)行討論。但是未見對于不同地區(qū)的蟲株感染力比較的報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)三個(gè)不同地區(qū)小鼠的感染率不同，以新疆株感染性最強(qiáng)，提示蟲株存在種內(nèi)的毒力和致病性差異，可能與不同來源地囊液的過敏性及毒性的刺激有關(guān)，以及對宿主的易感性差異。

綜上所述，本研究成功建立3株不同源地的泡球蚴在BALB／c小鼠穩(wěn)定傳代保種動物模型，通過對青海、新疆、四川地區(qū)的泡球蚴感染情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)新疆株的感染力更強(qiáng)，在包囊和肝臟內(nèi)檢測到原頭蚴均以新疆株為多，后續(xù)對泡球蚴感染的分子機(jī)制研究，可以選取新疆株進(jìn)行研究。