妊娠期糖尿病患者來源的胎盤外泌體對內皮細胞血管功能的影響

張艷賞，李 麗，霍 琰，崔京娜，李桂平

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）指妊娠期發生或首次發現的糖耐量異常，包括一部分在妊娠前已患有糖尿病但孕期首次被診斷的患者，是常見的妊娠并發癥之一。GDM不僅會增加胎兒并發癥，如巨大兒、新生兒低血糖、高膽紅素血癥等的發生率，還會增加孕婦罹患心血管疾病和2型糖尿病的風險，嚴重危害母嬰健康。然而，迄今為止GDM的發病機制尚不明確。胎盤作為連接母體與胎兒的重要器官，其通過氣體交換、營養供給及代謝廢物排出等功能對妊娠的維持發揮關鍵作用。既往研究證實GDM患者胎盤較正常胎盤明顯增大，胎盤毛細血管表面積增加，毛細血管增生且內皮細胞的增殖活性顯著升高。外泌體是由雙層磷脂分子包裹的囊泡樣小體，直徑為30～150 nm，其能夠通過獨特的分子結構實現多種功能，如細胞間信息交換。而細胞間的信號傳遞對于胎盤組織中各種細胞正常功能的發揮尤為重要。因此，外泌體可能參與了GDM的病理生理學機制。然而針對胎盤外泌體對內皮細胞功能的研究尚鮮有報道。該研究旨在探討GDM患者胎盤外泌體對血管內皮增殖、遷移等能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年5月—2019年5月河北省人民醫院產科住院的GDM孕產婦患者30例。GDM的診斷按照第9版《婦產科學》的標準，即在妊娠的第24～28周空腹口服75 g葡萄糖進行糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT），其中當空腹血糖≥5.1 mmol／L，或服糖后1 h血糖≥10.0 mmol／L，或服糖后 2 h血糖≥8.5 mmol／L中任意一點血糖值達到上述標準即可診斷為GDM。所有受試者孕產婦均為單胎妊娠，排除妊娠合并心腦血管、肺、肝、腎等疾病，妊娠合并甲狀腺等內分泌疾病及妊娠前即診斷為糖尿病者。本研究經河北省人民醫院倫理委員會審批，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 細胞系與主要試劑 人臍靜脈內皮細胞系（HUVEC）購自中國科學院上海細胞庫；RPMI-1640、DMEM／HG、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；Trizol試劑（美國 Invitrogen公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青鏈霉素混合液（均為100 U／ml，杭州四季青生物公司）；內皮細胞生長因子（美國Sciencecell公司）；PCR試劑盒（日本 TaKaRa）；CD63多克隆抗體（美國 Bioworld公司）；CD81、PLAP及 GAPDH單克隆抗體（美國 SantaCruz公司）；Transwell小室（5μm，美國 Millpore公司）；辣根過氧化酶標記（HRP）的二抗（廣州晶彩）；其他試劑均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 標本采集及提取胎盤外泌體 參考相關文獻方法采集胎盤組織及提取胎盤外泌體，簡述如下：胎盤娩出后立即剪取胎兒面約10 g絨毛組織，置于預冷的無菌生理鹽水中并迅速帶回實驗室。含5%青鏈霉素的無菌生理鹽水反復漂洗絨毛組織后，無菌外科剪將其剪碎至約10 mg左右并置于去除外泌體的含5%BSA與1%青鏈霉素的RPMI-1640培養液中，于37℃、5% CO恒濕培養箱進行培養，24 h后收集組織培養上清液進行外泌體提取。利用超速離心法分離胎盤組織塊培養上清液中的外泌體。按下列順序依次進行離心：4 000 r／min離心 30 min，17 000 r／min離心 25 min，上清液經0.2 mm濾網過濾后，取過濾液經110 000 r／min離心2 h。取底層沉淀，不含外泌體的PBS重懸后，經不連續蔗糖密度梯度（20%與40%）進行純化，100 000 r／min離心4 h后取中間層溶液加入1／4體積的40%PEG6000，充分混勻后置于37℃孵箱中進行孵育過夜，次日10 000 r／min離心1 h，沉淀物即為提取的胎盤外泌體。

1.3.2 外泌體的鑒定 取20μl不含外泌體的PBS稀釋10μg上述分離所得的胎盤外泌體，3.5%的多聚甲醛固定后滴加到銅網上，2%的鈾酸鹽染色，晾干后應用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察外泌體形態；參考Malvern激光散射粒度測定儀的使用說明通過動態光散射（dynamic light scattering，DLS）測量外泌體的粒徑大小及分布。應用Western blot實驗檢測外泌體標志性蛋白CD81、CD63及胎盤外泌體特征性蛋白分子PLAP的表達。

1.3.3 細胞培養 常規復蘇HUVEC后使用含10%FBS、1%青鏈霉素與10 ng／ml內皮細胞生長因子的DMEM／HG培養液于37℃、5% CO恒溫培養箱進行培養。待HUVEC貼壁生長融合至80%時，0.25%的胰酶進行消化傳代。

1.3.4 PKH67／DAPI雙染對外泌體進行標記及追蹤 收集分離純化的外泌體，根據KPH67試劑說明書進行標記外泌體，同時根據DAPI染料說明書將HUVEC進行染核，再將KPH67標記的外泌體加入到經DAPI染核的HUVEC中，于37℃、5% CO恒溫培養箱進行培養12 h，熒光共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.3.5 EdU染色法及CCK-8實驗檢測外泌體對內皮細胞增殖能力的影響 取處于對數生長期的HUVEC，細胞計數后以4×10個／孔接種于24孔板中，按“1.3.3”項下方法進行培養，待細胞生長融合至60%時，按加入胎盤外泌體濃度的不同將HUVEC分為4組：正常培養的對照組（negative control，NC組），A組為含10μg／ml胎盤外泌體，B組為含20μg／ml胎盤外泌體；C組為含40μg／ml胎盤外泌體。①EdU染色法：按EdU試劑說明書進行操作，用DMEM／HG按1∶1 000稀釋EdU溶液，并制成含50μmol／L EdU的DMEM／HG培養液。上述各組細胞于37℃、5% CO恒溫培養箱中培養48 h后，棄除培養液，PBS輕輕洗滌細胞后，向每孔加入4%的多聚甲醛于室溫下進行固定30 min，棄除固定液，每孔加入200μl含2 mg／ml的甘氨酸溶液充分振蕩5 min，棄除甘氨酸溶液后 PBS洗滌細胞，每孔加入200μl Apollo染色反應液進行避光孵育30 min，加入Hoechst3342復染細胞核30 min，置于熒光顯微鏡使用550 nm的激發光觀察Appolo567染色，使用350 nm的激發光觀察Hoechst3342染色，最后拍照計算細胞核（Hoechst）與增殖細胞（Appolo）染色的細胞數，Appolo／Hoechst比值即為細胞增殖率。每組設置5個復孔，實驗單獨重復3次。②CCK-8實驗：取生長狀態良好的HUVEC，常規消化后調整細胞密度至2×10個／孔接種于96孔板中，并按上述于37℃、5% CO恒溫培養箱中進行培養過夜后，按上述方法向每孔加入不同濃度的外泌體并將細胞分為4組，即 NC組，A組（10μg／ml），B組（20μg／ml），C組（40μg／ml）及 10μl CCK-8試劑，分別于0、12、36、48 h后置于酶標儀570 nm波長處檢測每孔吸光度值（OD），每個時間點每組設置5個復孔，并繪制各組細胞的生長曲線。

1.3.6 內皮細胞劃痕實驗 預先在6孔板每個孔的底部使用記號筆劃2條間隔為5 mm的橫線，再將處于對數生長期的HUVEC以4×10個／孔接種于6孔板中，并按“1.3.5”項下方法將細胞分為NC組、A組、B組及C組，按上述方法進行培養，待細胞生長融合至80%時使用20μl移液器槍頭在細胞培養面垂直于記號筆劃線，PBS沖洗細胞3次以去除刮除掉的細胞。再向每孔加入含不同濃度的外泌體培養液，于細胞培養箱中繼續培養24 h后，倒置顯微鏡下拍攝，使用Image J軟件測量細胞間距離進行分析。

1.3.7 內皮細胞遷移實驗 Martrigel基質膠4℃溶解后，用不含FBS的RPMI-1640培養基以1∶8進行稀釋，并取40μl稀釋后的基質膠包被Transwell上室，于細胞培養箱中靜置4 h，待膠凝固后備用。取處于對數生長期的HUVEC細胞進行常規消化后，細胞計數后調整密度至5×10個／ml，取200 μl的細胞懸液接種至24孔板的Transwell上室中，將Transwell下室按“1.3.5”項下方法在600μl的培養液中加入不同濃度的胎盤外泌體，即將細胞分為NC組、A組、B組及C組。每組設定3個復孔，于細胞培養箱培養24 h。取出上室，PBS沖洗2次，并用濕棉簽輕輕擦拭小室上層未穿出細胞，無水酒精固定15 min，室溫下晾干，0.1%的結晶紫于室溫下染色30 min，PBS沖洗2次后于倒置顯微鏡下觀察穿出的細胞數，每組隨機選取5個視野進行計數。

1.3.8 內皮細胞成管實驗 按上述“1.3.7”項下方法溶解、稀釋基質膠后，取40μl均勻平鋪于12孔板中。取處于對數生長期的HUVEC，將調整細胞密度至2×10個／孔接種至12孔板中，在600μl的培養液中加入不同濃度的外泌體，并按“1.3.5”項下方法將細胞分為NC組、A組、B組及C組。每組設定3個復孔，于細胞培養箱培養24 h后，于顯微鏡下觀察小管形成情況，計算形成的管樣節點數。

1.3.9 Western blot實驗 分別應用外泌體RNA／蛋白提取試劑盒和RIPA細胞裂解液與蛋白酶抑制劑進行提取胎盤外泌體和內皮細胞中的總蛋白。BCA法進行蛋白定量，按照1∶4向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳進行蛋白分離，采用濕轉法將分離的蛋白轉至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后，分別加入 CD81（1∶500）、CD63（1∶500）、PLAP（1∶800）GAPDH（1∶1 000）一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min／次，以辣根酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，以 TBST溶液清洗3次，5 min／次。最后均勻滴加ECL發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH的比值作為其相對含量。以上實驗單獨重復3次。

2 結果

2.1 胎盤外泌體的培養及攝取 TEM觀察結果顯示胎盤外泌體呈典型的圓形或橢圓形囊泡結構，直徑為40～130 nm（圖1A），DLS粒徑分析顯示分離所得的外泌體多數分布在49～131 nm之間，主要集中在80 nm（圖1B），Western blot結果顯示胎盤外泌體高表達外泌體特征性蛋白CD81、CD63及胎盤外泌體特征性蛋白分子抗體PLAP（圖1C）。PKH67（綠色熒光）標記的胎盤外泌體與DAPI（藍色熒光）染核后的HUVEC共培養12 h后，共聚焦顯微鏡檢測發現，PKH67熒光標記的胎盤外泌體進入HUVEC細胞質內（圖1D）。

圖1 外泌體的鑒定及攝取

2.2 胎盤外泌體對內皮細胞增殖的影響 EdU染色法及CCK-8檢測結果表明GDM胎盤外泌體能夠提高內皮細胞的增殖活性，且外泌體濃度越高其對內皮細胞的促增殖效應越強。其中CCK8實驗結果顯示：與NC組36 h及48 h的吸光度值比較［（0.41±0.09），（0.48±0.07）］，B組和 C組處理內皮細胞36 h［（0.63±0.02），（0.71±0.04）］與 48 h［（0.77±0.10），（0.84±0.03）］后細胞的增殖活性升高，差異均有統計學意義（F＝14.66，P＜0.05），A組對應細胞的增殖活性變化［（0.44±0.05），（0.52±0.03）］，差異無統計學意義（F＝2.76，P＞0.05）；EdU實驗結果顯示：與NC組細胞增殖率比較（12.14±7.03）%，B組和 C組的細胞增殖率［（31.27±3.22）%，（33.56±9.10）%］增加（F＝11.02，P＜0.05），而 A組細胞的增殖率（16.39±4.55）%變化差異無統計學意義（F＝4.05，P＞0.05），見圖2、3。

圖2 CCK-8實驗檢測胎盤外泌體對內皮細胞增殖活性的影響

圖3 EdU實驗檢測胎盤外泌體對內皮細胞增殖活性的影響 ×40

2.3 胎盤外泌體對內皮細胞遷移及侵襲能力的影響 細胞劃痕及侵襲實驗結果表明，胎盤外泌體處理內皮細胞24 h后，能夠促進內皮細胞的遷移及侵襲能力，且外泌體濃度越高其對內皮細胞的遷移及侵襲能力的促進作用越強。其中劃痕實驗結果顯示：與NC組細胞的遷移距離 （0.14±0.08）cm比較，B組遷移距離為（0.36±0.11）cm、C組為（0.57±0.20）cm，差異均有統計學意義（F＝13.09，P＜0.05），A組遷移距離（0.16±0.03）cm，差異無統計學意義（F＝2.17，P＞0.05）；Transwell侵襲實驗結果顯示：與 NC組侵襲細胞數（68.20±6.23）個比較，A組侵襲細胞數為（122.00±9.47）個、B組為（189.50±8.65）個、C組為（189.60±10.49）個，這提示外泌體刺激內皮細胞24 h后，細胞的侵襲能力增強，差異均有統計學意義（F＝33.72，P＜0.05），見圖4、5。

圖4 胎盤外泌體對內皮細胞遷移功能的影響

圖5 胎盤外泌體對內皮細胞侵襲功能的影響

2.4 胎盤外泌體對內皮細胞小管形成能力的影響成管實驗結果顯示：胎盤外泌體處理內皮細胞24 h后，能夠促進內皮細胞的成管能力，且外泌體濃度越高其成管能力的促進作用越強。其中與NC組細胞形成的節點（12.17±5.87）個比較，B組為（55.90±12.55）個、C組為（81.41±15.03）個，細胞的成管能力增強，差異均有統計學意義（F＝44.36，P＜0.05），A組細胞形成節點為（14.24±3.16）個，成管能力與NC組比較差異無統計學意義（F＝5.04，P＞0.05），見圖6。

圖6 胎盤外泌體對內皮細胞成管能力的影響

3 討論

GDM是妊娠期婦女常見的并發癥，其常常伴發胎盤形態與功能的異常。大量研究顯示GDM患者的胎盤較正常胎盤組織呈現出過度增長狀態，這與GDM孕產婦的新生兒體質量增加密切相關。而血管內皮細胞作為糖尿病發展過程中敏感且易受損的細胞，其對GDM的發生發展起著重要的作用。

滋養層細胞作為胎盤組織主要的組成細胞，可分為絨毛滋養細胞（villous cytotrophoblasts，VCT）與絨毛膜外滋養層細胞（extravillous cytotrophoblasts，EVT），其中EVT是胎盤錨定于母體蛻膜組織的關鍵成分，同時也是妊娠母血直接接觸的胎盤細胞，所以目前胎盤外泌體的基礎研究主要集中在EVT。外泌體作為細胞與組織間重要的信息載體，其能夠將母體特征性生物信息物質（如蛋白、DNA、mRNA／miRNA／lncRNA、脂類等）傳遞給靶細胞從而參與調控后者功能。已有研究證實妊娠期的胎盤組織能夠通過釋放外泌體來介導母胎界面的免疫調節、子宮螺旋動脈的重塑及胎盤屏障的形成等重要事件，如在用低氧（1%的氧濃度）模擬子癇前期（pre-eclampsia，PE）環境下，滋養細胞系 HTR-8／SV-neo分泌的外泌體能夠抑制血管內皮細胞的遷移，并誘導其釋放高濃度的腫瘤壞死因子α，而后者又能抑制滋養細胞的增殖并促進其發生凋亡并損害內皮細胞的結構，阻礙螺旋動脈的重鑄，從而誘發PE的發生。Pillay et al進一步研究發現 PE患者循環中胎盤外泌體的數量及所負載的信息物質均較正常孕婦存在顯著變化，這提示胎盤外泌體可能在PE中具有重要的病理生理學作用，有望使其成為PE的診斷及預后的生物標記物；在妊娠期免疫耐受的相關研究中發現，胎盤外泌體表達的活化NK細胞受體NKG2D的第二配體，即 UL-16結合蛋白（UL-16 Binding proteins，ULBP）可通過下調 NK細胞、γδT細胞表面的NKG2D受體表達從而降低上述免疫細胞的細胞毒性，進而誘導母體對胎兒免疫耐受，維持正常的妊娠過程。此外，胎盤外泌體含有功能性的Fas配體和TRAIL分子，能夠以劑量依賴性的方式誘導T細胞和外周單核細胞發生凋亡從而調節母體免疫狀態。而在GDM中，最新的研究發現GDM患者體內胎盤外泌體分泌水平與正常女性比較，其在孕早期升高2.2倍，孕中期增加1.5倍，孕晚期約增加1.8倍，這提示外泌體與GDM的病理生理學發生機制密切相關。此外，Salomon et al研究發現高糖、低氧環境更能促進人胎盤絨毛膜癌細胞BEWO對外泌體的釋放。本研究首先結合胎盤組織塊培養及超速離心法分離純化胎盤外泌體，經透射電鏡，DLS粒徑分析及Western blot進行鑒定，結果顯示胎盤外泌體直徑范圍在40～130 nm，80 nm處形成唯一單峰。胎盤外泌體高表達外泌體特征性蛋白CD81、CD63及胎盤外泌體特征性蛋白PLAP，后者是EVT分泌的特異性蛋白，其僅存在于妊娠婦女中。KH67／DAPI雙染色實驗表明胎盤外泌體能夠被內皮細胞所攝取。隨后我們繼續探究胎盤外泌體對血管內皮細胞增殖、遷移、侵襲及成管能力的影響，結果顯示胎盤外泌體能夠以濃度依賴性發揮對內皮細胞上述功能的促進作用，即濃度越高，胎盤外泌體對內皮細胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力的促進作用越強。這與既往對GDM患者中胎盤外泌體的功能研究一致。

綜上所述，GDM患者胎盤外泌體能夠顯著促進內皮細胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力，從而促進GDM的發展。然而外泌體在細胞間通過其所包裹的蛋白質、脂質、mRNA、miRNA等發揮作用，如在Shen et al研究發現 PE患者胎盤外泌體通過miR-155抑制內皮細胞表達具有舒張血管作用的內皮型一氧化氮合酶（eNOS），從而導致血管收縮，血壓升高。在GDM中研究發現，GDM患者胎盤外泌體特異性 C19MC miRNA，包括-518a-5p、-518b、-518c等表達顯著增加，其可能對GDM的發生發展密切相關。本課題組將會在后續研究中深入探究GDM外泌體具體通過何種分子發揮對內皮細胞的上述功能影響，以期進一步揭示GDM的發生發展機制，為臨床更好地預防及治療GDM提供理論基礎。