EZH2對抗結(jié)核藥物性肝損傷小鼠Nrf2-ARE通路的影響

賈云鵬，徐 杰，馬 玉，張 咪，吳冬雪，王 雪，朱晗瑀，馮福民，2

2018年全球約有1 000萬新發(fā)結(jié)核病患者，124萬死亡病例。異煙肼、利福平和吡嗪酰胺為WHO推薦的結(jié)核病治療藥物，但治療過程中會產(chǎn)生副作用，其中以抗結(jié)核藥物性肝損傷（anti-tuberclosis drug-induced liver injury，ADLI）最為突出。近來表觀遺傳學(xué)發(fā)展迅速，為各類肝臟疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)。

組蛋白甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，果蠅zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）為特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可對組蛋白H3第27位賴氨酸進(jìn)行三甲基化修飾（histone 3 lysine 27 trimethylation，H3K27me3），進(jìn)而調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基因的沉默，例如EZH2可通過 H3K27me3修飾調(diào)節(jié)肺癌中氧化水平。Nrf2-ARE通路是調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原水平的重要通路，該課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ADLI小鼠模型中Nrf2-ARE通路被激活，小鼠肝臟Ⅱ相藥物代謝能力和抗氧化能力增強(qiáng)。該研究試圖在ADLI小鼠中探討EZH2對Nrf2-ARE抗氧化應(yīng)激通路的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 昆明小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，異煙肼、利福平和吡嗪酰胺購自沈陽紅旗制藥公司，siRNA oligo購自上海市吉瑪公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，PrimeScriptRT reagent Kit、SYBRPremix Ex TaqII購自日本TaKaRa公司，ELISA試劑盒購自北京安迪華泰公司，酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司，擴(kuò)增儀購自美國BIO-RAD公司，熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 小鼠分組與處理 6周齡SPF級昆明小鼠共32只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動物實驗中心清潔動物房，小鼠自由進(jìn)食與飲水，交替照明各12 h，溫度控制在24℃左右，相對濕度60%～80%。實驗設(shè)施合格證編號：SYXK（冀）2015-0038，動物實驗獲得華北理工大學(xué)動物倫理委員會的同意。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將小鼠隨機(jī)分為以下4組。空白對照組：與模型組相同體積生理鹽水灌胃；模型組：異煙肼+利福平+吡嗪酰胺［90 mg／（kg·d）+135 mg／（kg·d）+315 mg／（kg·d）］劑量灌胃（劑量按照臨床成人正常用藥劑量的9倍計算所得）；實驗組：在模型組基礎(chǔ)上按照200 nmol／kg劑量第3天對小鼠尾靜脈注射EZH2-siRNA；陰性對照組：在空白對照組基礎(chǔ)上按照200 nmol／kg劑量第3天對小鼠尾靜脈注射EZH2-NC-siRNA。連續(xù)灌胃4 d，末次灌胃24 h后（即第5天）處死小鼠并收集血清和肝組織。

1.3 血清中ALT、AST檢測 采用微孔板法檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。酶標(biāo)儀測定各孔OD值，絕對OD值等于測定孔OD值減對照孔OD值，然后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個樣本的ALT（或AST）表達(dá)水平。

1.4 肝組織病理學(xué)觀察 小鼠肝組織標(biāo)本收集后用10%甲醛溶液固定，經(jīng)切片、脫蠟、樣本水化、蘇木精染色、分化與反藍(lán)、伊紅染色與脫水、風(fēng)干封片等步驟后將切片置于光學(xué)顯微鏡下，200倍視野采集圖片，采用DILI-PSS肝損傷病理評分系統(tǒng)進(jìn)行評分，評分等級分別為：不可能（1～2）、可能（3～4）、很可能（5～6）、極可能（7～8）和明確（9～10）。

1.5 肝組織 EZH2、Nrf2、NQO1和 HO-1 m RNA水平檢測 Trizol法提取總RNA，選擇酶標(biāo)儀檢測的OD值在1.8～2.0之間的RNA樣本。反轉(zhuǎn)錄體系總體系為20μl，其中Mix 4μl，RNA質(zhì)量為1 000 ng，則 RNA體積為1 000／RNA濃度，剩余體系用DEPC水補(bǔ)充至20μl。

qPCR法檢測 mRNA，反應(yīng)體系為20μl，Rox 0.4μl，上下游引物各 0.4μl，dHO 6.8μl，cDNA 2 μl。條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共 50個循環(huán)。2計算mRNA表達(dá)水平。引物序列如下，GAPDH：上游 5′-TTG GTA TCG TGG AAG GAC-3′，下 游 5′-TCA AAG GTG GAG GAG TGG-3′；EZH2：上游 5′-GGA CCA CAG TGT TAC CAG CAT-3′，下游 5′-GTG GGG TCT TTA TCC GCT CAG-3′；Nrf2：上游 5′-CAG TGC TCC TATGCG TGA A-3′，下游 5′-TCT GGG CGG CGA CTT TAT-3′；NQO1：上游5′-GAA GAC ATC ATTCAA CTA CGCC-3′，下游5′-GAG ATG ACT CGG AAG GAT ACT G-3′；HO-1：上游 5′-TCC TTG TAC CAT ATC TAC ACG G-3′，下游5′-GAG ACG CTT TAC ATA GTG CTG T-3′。

1.6 Western blot法檢測肝組織中EZH2、Nrf2蛋白水平 用RIPA裂解液和PMSF提取蛋白。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜置于5%脫脂奶粉搖床室溫封閉，洗滌，分別用 EZH2（1∶2 000）和 Nrf2（1∶2 000）一抗4℃搖床上孵育過夜，次日膜經(jīng)洗滌過后于搖床上室溫孵育二抗（1∶5 000），采用ECL顯色試劑在凝膠成像系統(tǒng)顯影并定量。

1.7 ELISA法檢測肝組織中NQO1、HO-1蛋白水平 采用ELISA試劑盒檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀上以450 nm波長測量各孔OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后將各組樣品OD值帶入，計算得到樣品實際濃度。

1.8 肝組織中Nrf2啟動子區(qū)H3K27me3水平檢測 Nrf2啟動子區(qū)H3K27me3水平檢測采用染色質(zhì)免疫共沉淀法。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清中ALT、AST水平變化 與空白對照組比較，模型組 ALT、AST水平升高（P＜0.05），陰性對照組未見改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，實驗組水平有所降低，但仍高于空白對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠血清中ALT、AST水平比較（U／L，±s，n＝8）

2.2 小鼠肝組織病理學(xué)結(jié)果與評價 經(jīng)DILI-PSS病理評分系統(tǒng)計算，空白對照組、模型組、實驗組和陰性對照組肝損傷等級分別為1、8、6、1，證明模型組發(fā)生肝損傷，而實驗組與模型組比較肝損傷程度較輕。HE染色結(jié)果見圖1，空白對照組與陰性對照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間界限清晰，未見病理學(xué)改變。模型組可見肝細(xì)胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞且部分細(xì)胞核染色變深，而實驗組與模型組相比有所緩解。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化 HE×200

2.3 小鼠肝組織中EZH2和Nrf2-ARE通路相關(guān)基因mRNA水平 與空白對照組比較，模型組EZH2水平降低（P＜0.05），實驗組進(jìn)一步降低（P＜0.05）。與空白對照組比較，模型組Nrf2、NQO1和HO-1水平升高（均P＜0.05）。另外，實驗組小鼠體內(nèi)EZH2水平被抑制后，與模型組比較，實驗組小鼠Nrf2、NQO1和 HO-1 mRNA水平進(jìn)一步升高（均P＜0.05），且陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織相關(guān)指標(biāo)mRNA水平

2.4 肝組織中EZH2和Nrf2-ARE通路相關(guān)蛋白水平 EZH2和Nrf2-ARE通路相關(guān)蛋白結(jié)果見圖3，蛋白表達(dá)趨勢與mRNA趨勢一致。

圖3 各組小鼠肝組織相關(guān)指標(biāo)蛋白水平

2.5 肝組織中Nrf2啟動子區(qū)H3K27me3水平繼續(xù)對各組小鼠肝組織Nrf2啟動子區(qū)H3K27me3的水平進(jìn)行檢測。與空白對照組比較，模型組Nrf2啟動子區(qū)H3K27me3的水平降低（P＜0.05）。而實驗組在抑制EZH2后，與模型組比較，實驗組Nrf2啟動子區(qū) H3K27me3的水平進(jìn)一步降低（P＜0.05），且陰性對照組與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

圖4 各組小鼠肝組織Nrf2啟動子區(qū)H3K27me3水平

3 討論

近年來，在結(jié)核病的研究中也開始涉及到各類表觀遺傳機(jī)制，因此，本研究從表觀遺傳學(xué)角度探討ADLI過程中的相關(guān)機(jī)制。首先采用臨床常用的異煙肼+利福平+吡嗪酰胺的用藥方案對小鼠進(jìn)行灌胃處理，結(jié)果顯示模型組小鼠血清中肝功能指標(biāo)ALT和AST均出現(xiàn)上升，且HE染色結(jié)果顯示肝組織出現(xiàn)細(xì)胞壞死及凋亡，提示造模成功。

EZH2作為多梳抑制復(fù)合物2的催化亞基，是一種高度保守的特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過對靶基因進(jìn)行三甲基化修飾，從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因抑制或者沉默的作用。EZH2在各類疾病中存在差異表達(dá)，例如感染急性期嚴(yán)重登革熱患者較非嚴(yán)重登革熱患者外周血中EZH2的表達(dá)下調(diào)，在疾病早期可作為反映疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。在非酒精性脂肪肝病中，同樣發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白出現(xiàn)下調(diào)，并證明EZH2可促進(jìn)脂肪變性，下調(diào)炎癥基因和特異性microRNAs的表達(dá)，從而加快非酒精性脂肪肝病的發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠EZH2在mRNA和蛋白水平均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，可見一線抗結(jié)核藥物聯(lián)用引起了相關(guān)表觀遺傳學(xué)改變，導(dǎo)致甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2表達(dá)水平降低，這說明EZH2可能參與到ADLI過程中，并與肝損傷的程度有密切的聯(lián)系。

正常情況下，Nrf2與Keap1蛋白結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中，Nrf2的功能暫時受到抑制，當(dāng)機(jī)體受到親電子物質(zhì)或者氧化應(yīng)激因子刺激后，Nrf2與Keap1蛋白解離由胞質(zhì)跨膜進(jìn)入細(xì)胞核中，從而與ARE蛋白識別并結(jié)合，啟動下游抗氧化應(yīng)激因子如NQO1和HO-1等的轉(zhuǎn)錄，最終增強(qiáng)機(jī)體對抗有害化學(xué)物質(zhì)帶來的毒性，并提高機(jī)體抗氧化還原的能力，因此Nrf2-ARE通路可能是治療ADLI的潛在靶點。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素衍生物F10處理前列腺癌細(xì)胞后可使得Nrf2和相關(guān)的Ⅱ期解毒基因表達(dá)水平增加，因為F10有效地減少了H3K27me3在Nrf2啟動子上的水平，激活了Nrf2-ARE通路。同樣在前列腺癌中，Yang et al利用珊瑚醇酸對前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)降低了H3K27me3在Nrf2啟動子區(qū)域的三甲基化，并誘導(dǎo)了Nrf2、NQO1和HO-1的表達(dá)水平的升高，而在Nrf2基因敲除的前列腺癌細(xì)胞中并沒有相同的現(xiàn)象。為此，本研究對實驗組小鼠進(jìn)行了特異性小干擾RNA轉(zhuǎn)染，抑制EZH2的表達(dá)水平，進(jìn)而觀察EZH2下調(diào)對Nrf2-ARE通路的影響。結(jié)果顯示，模型組小鼠體內(nèi)Nrf2-ARE通路水平上升，實驗組小鼠在抑制EZH2后，其Nrf2-ARE通路表達(dá)水平進(jìn)一步上升，且小鼠肝損傷程度有所緩解。提示EZH2對Nrf2-ARE通路具有一定抑制作用，通過抑制小鼠體內(nèi)EZH2表達(dá)水平可上調(diào)Nrf2-ARE通路，提高機(jī)體抗氧化還原能力，進(jìn)而改善ADLI。

最后本研究對各組小鼠肝組織中Nrf2啟動子區(qū)H3K27me3水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組較空白對照組有所降低，在對實驗組進(jìn)行轉(zhuǎn)染抑制后H3K27me3水平進(jìn)一步降低。結(jié)果提示EZH2可能是通過在 Nrf2啟動子區(qū)募集H3K27me3來調(diào)控Nrf2-ARE通路，進(jìn)而來影響肝損傷過程。

綜上所述，以上研究結(jié)果證明了EZH2在ADLI中存在表達(dá)下調(diào)，通過抑制EZH2表達(dá)可改善肝損傷程度，EZH2對ADLI的影響可能是通過在Nrf2啟動子區(qū)進(jìn)行H3K27me3修飾，進(jìn)而通過調(diào)控Nrf2-ARE抗氧化應(yīng)激通路來實現(xiàn)的，本研究為結(jié)核病的預(yù)防與治療提供了理論基礎(chǔ)，具有一定的臨床意義。