多肽301 LARSLKT307抑制心肌分化的細胞實驗研究

許 耿，朱金改，喻博識，韓樹萍，顧海濤，余章斌

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）由各種因素導致的胚胎時期心臟和血管發育障礙，造成心臟形態、功能及病理生理異常。心臟發育是一個時空調控的過程，包括對基因表達和信號通路的精確控制，如Notch信號通路，以及一系列重要的形態變化，而心肌分化是心臟發育的一個重要組成部分，心肌分化的異常往往是導致CHD發生的關鍵。多肽LARSLKT是從法洛四聯癥流產胎兒心肌組織中發現的一條生物學活性肽。前期的研究揭示該多肽可以抑制斑馬魚的心臟發育，導致斑馬魚胚胎期心臟的發育及功能異常，但其在細胞水平抑制心肌分化的影響及機制尚無報道。P19細胞是來源于小鼠畸胎瘤中的多功能干細胞，具有自我復制能力和分化潛能，是研究胚胎期心肌分化的良好的細胞模型。因此，該研究擬在P19細胞水平檢測多肽LARSLKT對心肌細胞分化的影響，并初步探究其發揮功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與主要儀器 TRIzol（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒、定量 PCR試劑盒、SYBR Green Master Mix（日本TaKaRa公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國 Sigma公司）；PBS、α-MEM培養基、FBS胎牛血清、青霉素-鏈霉素（美國Gibco公司）；Dapi（4，6-二氨基-2-苯基吲哚，Sigma）；0.25%胰蛋白酶（美國 Servicebio公司）；Real-time PCR儀（型號：ViiA7，美國UVP公司）；恒溫培養箱（上海茸研儀器公司）；紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；兔抗人 cTnT和GATA4抗體（武漢三鷹公司）；羊抗兔IgG（英國Abcam公司）。

1.1.2 細胞 P19細胞購自美國典型培養物保藏中心。

1.1.3 多肽 多肽LARSLKT、亂序肽ALKTLRS和FITC標記的多肽FITC-LARSLKT均委托上海科肽公司合成。

1.2 方法

1.2.1 P19細胞培養與分化 將P19細胞置于α-MEM完全培養基（含體積分數10%胎牛血清、100 U／ml青霉素和100 mg／L鏈霉素）中，于 37℃、5% CO恒溫培養箱中培養，每隔2 d更換1次新鮮培養液，待細胞融合度達到90%左右時，用胰酶進行消化，并依據細胞的生長狀況按一定比例進行傳代培養。取對數生長期的P19細胞進行消化，并將消化后的細胞置于誘導培養基（在α-MEM完全培養基中加入1%DMSO即為誘導培養基）中，調整其細胞濃度為1×10／ml，取15 ml細胞懸液加入到直徑9 cm的培養皿中，于37℃、5% CO恒溫培養箱中培養，每隔2 d更換1次新鮮的誘導培養基。誘導當天記為第0天，3～4 d后細胞開始聚集形成類胚體，將其轉移到6孔培養板中，每孔10個類胚體，并換成α-MEM完全培養基繼續培養，每隔2 d更換1次新鮮的α-MEM完全培養基。在誘導細胞分化的第0、4、10天，用倒置顯微鏡觀察形態變化并收集細胞提取RNA。

1.2.2 多肽的基本生物信息學分析 在線Pep-Draw Tool（http：／／www.tulane.edu／）和 ProtParam（https：／／web.expasy.org／protparam／）工具繪制多肽的結構和分析其理化性質，通過 Uniprot（http：／／www.uniprot.org／）蛋白數據庫確定該肽在前體蛋白中的位置，Blast法分析該條多肽的保守性。

1.2.3 熒光多肽入胞實驗 在37℃、5% CO的孵箱中，用α-MEM完全培養基培養P19細胞，每隔2 d換1次培養液，至50%左右融合度時加入熒光素標記多肽，培養箱孵育1 h，用甲醇固定10 min，加入Dapi對細胞核進行染色，并進行圖像采集。

1.2.4 RNA提取、反轉錄、定量PCR 收集誘導第0、4、10天的細胞，按說明書所述，總RNA用TRIzol分離提取RNA。通過TaKaRa反轉錄試劑盒對RNA反轉錄。實時定量PCR采用SYBR Green Master Mix在Real-Time PCR儀中進行，結果通過2方法進行分析，所有目的基因通過GAPDH作歸一化處理，引物序列見表1。

表1 實時定量PCR目的基因的引物

1.2.5 蛋白質免疫印跡實驗（Western blot） 收集誘導分化第10天的細胞，使用RIPA法提取總蛋白，并添加蛋白酶抑制劑（PMSF），BCA法檢測蛋白濃度。SDS／PAGE凝膠分離蛋白，并將蛋白轉移到PVDF膜上，使用GATA4、cTnT及GAPDH抗體孵育蛋白，最后用超敏ECL化學發光試劑盒檢測曝光蛋白條帶，并將GAPDH作為內參。

2 結果

2.1 多肽LARSLKT的生物信息學分析 生物信息學分析結果揭示，多肽LARSLKT由7個氨基酸組成（圖1A），相對分子質量為787.49 kDa，等電點的 pH值為11.52，凈電荷為2 e，疏水性為+11.22 Kcal／mol，不穩定指數為 59.21。通過 Uniprot網站分析發現其位于Talin蛋白的301～307氨基酸位點，并發現在人、大鼠、小鼠、馬、雞Talin蛋白的該段多肽序列高度一致（圖1B），提示多肽的保守性較高，可能在生物的生命進程中發揮重要作用。

圖1 多肽301 LARSLKT307的生物信息學分析

2.2 FITC標記多肽LARSLKT對P19細胞的親和力研究 為了探究多肽LARSLKT對P19細胞的親和力，本研究向融合度約50%的P19細胞加入FITC標記的多肽LARSLKT，結果中發現P19細胞中富集綠色熒光（圖2），表明多肽可以進入P19細胞。

圖2 FITC標記多肽301 LARSLKT307對P19細胞的親和力研究

2.3 多肽LARSLKT抑制P19細胞分化 為了研究多肽能否抑制細胞分化，使用倒置顯微鏡觀察P19細胞誘導分化成心肌的過程。誘導分化第4天，與對照組及亂序肽組比較，多肽組生成的細胞體不規則，邊緣粗糙不平，形態較差。誘導分化第10天，對照組及亂序肽組以胚胎樣小體為中心均勻向四周輻散生長，而多肽組細胞部分碎裂，向外生長形態紊亂，細胞厚薄不一（圖3）。結果提示多肽LARSLKT可抑制P19細胞分化。

圖3 多肽301 LARSLKT307抑制P19細胞分化

2.4 多肽LARSLKT抑制P19細胞分化相關基因表達 為了進一步研究多肽對P19細胞分化的影響，本研究對心肌分化標志物GATA4及cTnT進行了qPCR檢測。結果表明，與對照組及亂序肽組比較，多肽組的心肌分化標志物GATA4及cTnT基因mRNA表達在誘導分化第4天及第10天下降，差異有統計學意義（P＜0.05）（表 2、3、圖 4A、B），提示多肽LARSLKT可抑制P19分化標志基因mRNA的表達。Western blot實驗顯示，與對照組GATA4（0.54±0.03）和 cTnT（0.47±0.05）及亂序肽組GATA4（0.57±0.02）和 cTnT（0.47±0.01）比較，多肽組的心肌分化標志物GATA4（0.28±0.02）和cTnT（0.19±0.01）的蛋白表達量下降，GATA4表達差異有統計學意義（F＝132.698，P＜0.001），cTnT表達差異有統計學意義（F＝47.489，P＜0.001）（圖 4C、D），提示多肽LARSLKT可抑制P19分化標志基因GATA4和cTnT的蛋白表達。

圖4 多肽301 LARSLKT307抑制P19細胞分化相關基因mRNA及其蛋白表達

2.5 多肽LARSLKT可能通過抑制Notch1信號通路表達，發揮抑制P19細胞分化作用 為了研究多肽對P19細胞分化的可能作用機制，本研究收集了誘導分化第0、4、10天的P19細胞，對心臟發育相關通路Notch1信號通路的Notch1受體及靶基因Hey1及Hey2進行了qPCR檢測，與對照組和亂序肽組比較，除第4天Hey1組外，多肽組的Notch1、Hey1及Hey2基因mRNA表達在第4天及第10天均下降，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2、3和圖5），提示多肽LARSLKT可能通過抑制Notch1通路來影響P19細胞分化。

圖5 多肽301 LARSLKT307抑制Notch1信號通路相關基因mRNA表達

表2 第4天各組基因m RNA相對表達量

表3 第10天各組基因mRNA相對表達量

3 討論

CHD是新生兒圍產期死亡的主要原因之一，是最常見的出生缺陷。近年來，研究發現多肽能夠影響心臟的發育與功能，多肽作為參與心肌分化調控的關鍵因子，與心血管疾病的發生密切相關。多肽ELABELA可作為內源性的生長因子激活胚胎干細胞PI3K／AKT／mTOR信號通路，從而改變細胞周期，維持胚胎干細胞正常的自我增殖，對血管和心臟的發育至關重要。多肽能與膜受體、蛋白質相互作用，特異性識別結合細胞表面的受體，從而發揮激動劑、抑制劑或變構調節劑的功能，調控受體下游的信號通路，發揮其生物學功能。

多肽LARSLKT是本課題組從法洛四聯癥流產胎兒心肌組織表達圖譜中發現的一條表達異常的內源性多肽，前期研究發現多肽LARSLKT可以影響斑馬魚胚胎的心臟發育及功能，其可能是介導CHD發生的原因之一。該多肽來源于Talin蛋白，生物學活性多肽往往發揮與前體蛋白相關的功能。已有研究報道Talin蛋白是細胞黏附的關鍵蛋白，參與維持心臟Z盤穩定和內皮完整性，提示多肽LARSLKT可能在心臟的功能及結構的維持方面具有重要意義。

對多肽LARSLKT進行了生物信息學分析，發現該多肽位于Talin蛋白的301～307氨基酸位點，其分子量小、穩定性高、脂溶性好、保守性高，進一步的親和力實驗證實了該多肽可以進入細胞來發揮其作用。胚胎樣小體的形成是P19細胞分化為心肌細胞過程中的關鍵環節。在對P19細胞進行分化處理后發現，加入多肽的胚胎樣小體在誘導分化第4天呈現形態不規則，邊緣毛糙，狀態較差；將形成的胚胎小體進行貼壁處理，加入多肽的細胞部分碎裂，向外生長形態紊亂，細胞厚薄不一，提示多肽LARSLKT能夠抑制P19細胞形成胚胎樣小體。同時，本研究對誘導分化的P19細胞的分化標志基因cTnT及GATA4進行了檢測。cTnT是一種提示心肌晚期分化的心肌特異性蛋白，GATA4屬于心臟GATA亞家族，是心臟發育的重要轉錄因子。發現多肽LARSLKT能夠抑制P19細胞心肌分化基因mRNA及其蛋白的表達。綜上所述，多肽LARSLKT能夠抑制P19細胞分化心肌

Notch1信號通路在心室肌小梁形成和EMT等心臟發育的過程中起著重要作用，同時也是心肌分化的關鍵通路。Notch1基因主要表達于原始心管流出道內膜層，它對原始心管內膜細胞亞類的調節具有重要意義，該基因也是Hey1和Hey2基因的上游基因。有研究報道Hey1基因缺失的純合小鼠死于生后的第1周，該小鼠出現了三尖瓣畸形、室間隔缺損和法洛四聯癥，血流動力學分析還顯示了小鼠左心室功能的下降；敲除Hey2基因的小鼠會出現一個大的膜性室間隔缺損，同時伴隨有雙側心室肥大。本研究對Notch1、Hey1和 Hey2基因的表達進行了檢測，發現多肽組Notch1、Hey1和Hey2基因的表達低于對照組及亂序肽組，表明多肽LARSLKT可以影響 Notch1信號通路關鍵基因Notch1、Hey1和 Hey2的表達。這提示了多肽LARSLKT對P19細胞分化的抑制作用可能是通過下調Notch1信號通路的表達來完成的，但其具體機制需要進一步的研究，例如采取轉錄組學，挽救實驗等驗證多肽LARSLKT對Notch1信號通路的調控作用。

綜上所述，本文研究了多肽LARSLKT在細胞水平對心臟發育的影響，發現其能抑制P19細胞的分化，其作用可能是通過下調Notch1信號通路的表達來完成的。這為CHD的預防提供了新思路和實驗依據，但由于心臟發育是多基因多通路共同調控作用的結果，多肽LARSLKT抑制心臟發育的具體機制以及參與其中相互作用的其他信號仍有待進一步研究。