內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白質(zhì)羰基化在心力衰竭惡病質(zhì)中的作用

孔文文，張 昕

慢性心力衰竭患者的晚期可能會(huì)伴發(fā)惡病質(zhì)，其特征是體質(zhì)量減輕和骨骼肌功能障礙，患者表現(xiàn)為骨瘦如柴、行動(dòng)不便、生活難以自理，不僅嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，而且增加了病死率。但心力衰竭惡病質(zhì)的發(fā)病機(jī)制尚未清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞生理功能發(fā)生改變的一種發(fā)生于亞細(xì)胞器上的病理反應(yīng)。蛋白質(zhì)羰基化氧化應(yīng)激的結(jié)果是ERS的起始因子。肼苯噠（hydrazine，HYD）被認(rèn)為是一種強(qiáng)抗氧化劑，可降低體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。該研究通過(guò)異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）誘導(dǎo)的心力衰竭惡病質(zhì)大鼠模型，并使用HYD探討骨骼肌和心肌中蛋白質(zhì)羰基化、ERS與心力衰竭惡病質(zhì)發(fā)生的關(guān)系，明確HYD是否可以減輕ERS和蛋白質(zhì)羰基化的程度，抑制惡病質(zhì)進(jìn)展，為明確心力衰竭惡病質(zhì)發(fā)生機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，購(gòu)自北京維通利華公司，動(dòng)物許可證號(hào)為 SYXK（京）2017-0033，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物與試劑 ISO購(gòu)自大連美侖生物有限公司；HYD購(gòu)自Sigma公司；蛋白質(zhì)羰基含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Quant一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；2，4-二硝基苯肼購(gòu)自國(guó)藥集體化學(xué)試劑有限公司；抗DNP抗體購(gòu)自Sigma公司；C／EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（C／EBP hom ologous protein，CHOP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自江萊生物公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein78，GRP78）酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自江萊生物公司；ELISA試劑盒購(gòu)自蘇州酶免生物有限公司。

1.3 儀器 IE33彩色多普勒超聲診斷儀購(gòu)自飛利浦電器科技集團(tuán)（中國(guó)）有限公司；羅氏全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自四川沃特儀器公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；X71倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Thermal Cycler PCR儀購(gòu)自日本Bioer公司。

1.4 方法

1.4.1 分組及建立模型 90只大鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、ISO組和ISO+HYD組，每組各30只。ISO組和 ISO+HYD組注射 ISO［20 g／L，180 mg／（kg·d），隔天1次，共2次注射到大鼠腹股溝皮下］，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。1周后，ISO+HYD組每天用 HYD［1 g／L，7.2 mg／（kg·d）灌胃］灌胃6周。對(duì)照組和ISO組用生理鹽水進(jìn)行灌胃。

1.4.2 超聲心動(dòng)圖檢查 6周后，用水合氯醛（3%，0.1 ml／kg）麻醉大鼠，深麻后，固定大鼠四肢，用備皮刀備皮，由同一名有經(jīng)驗(yàn)的彩超醫(yī)生用飛利浦彩色超聲診斷儀的S4-2高頻探頭，選取大鼠左室乳頭肌短軸切面進(jìn)行測(cè)量：左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑 （left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）。每個(gè)大鼠測(cè)10個(gè)心動(dòng)周期，取其平均值。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：LVEF比對(duì)照組均值降低20%以上并且體質(zhì)量較對(duì)照組降低6%以上。

1.4.3 ELISA測(cè)定大鼠血清中腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、CHOP、GRP78的濃度 造模6周后，于心臟超聲檢查后次日，將大鼠禁食12 h，大鼠深麻后，鈍性分離腹主動(dòng)脈并采血，靜置30 min后，3 000 r／min離心5 min后分離出血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定大鼠血清BNP、CHOP和GRP78的濃度。

1.4.4 紫外分光光度法檢測(cè)蛋白質(zhì)羰基濃度 取每只大鼠同一部位心肌和股二頭肌，先于PBS液中沖洗3次，然后稱取約0.1 g組織樣品，用于快速蛋白質(zhì)羰基含量檢測(cè)。向0.1 g組織樣品中加入1 ml提取液，在玻璃勻漿器中進(jìn)行充分勻漿，后于4℃，5 000 r／min離心10 min，然后按照蛋白質(zhì)羰基含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)用紫外分光光度計(jì)于370 nm處進(jìn)行測(cè)定蛋白質(zhì)羰基濃度。

1.4.5 RT-PCR法檢測(cè)CHOP、GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá) 動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取三組大鼠心肌和骨骼肌中RNA，一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列見(jiàn)表1），檢測(cè)三組大鼠心肌和骨骼肌CHOP、GRP78 mRNA的表達(dá)水平，目的基因每個(gè)模板做3個(gè)復(fù)孔，測(cè)到Ct值取平均值，用 2法計(jì)算 CHOP、GRP78 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.4.6 免疫熒光檢測(cè)蛋白質(zhì)羰基的表達(dá)情況 取各組大鼠同一部位的心肌和股二頭肌，PBS液沖洗3次，立刻置于福爾馬林液中，室溫固定24 h后用于石蠟包埋切片，免疫熒光檢測(cè)蛋白質(zhì)羰基表達(dá)情況。結(jié)果判定：每張組織切片隨機(jī)選取5個(gè)不同的高倍鏡視野，用ImageJ軟件檢測(cè)每張圖片蛋白質(zhì)羰基的平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模結(jié)果 根據(jù)大鼠心力衰竭惡病質(zhì)模型成功的標(biāo)準(zhǔn)，ISO組有26只大鼠造模成功，ISO+HYD組有15只大鼠造模成功，對(duì)照組30只大鼠。

2.2 超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果 對(duì)照組、ISO+HYD組及ISO組LVEDD、LVESD依次升高，LVEF和FS依次降低（P＜0.05），見(jiàn)表2

表2 三組大鼠心功能比較（±s）

2.3 大鼠體質(zhì)量的比較 注射ISO前，三組大鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。6周后，三組大鼠體質(zhì)量與注射藥物前比較，ISO組平均下降9.26%，ISO+HYD組平均下降8.07%，對(duì)照組平均增加5.84%。6周后，三組大鼠體質(zhì)量比較，ISO組和ISO+HYD組大鼠體質(zhì)量均低于對(duì)照組（P＜0.05），同時(shí)ISO組低于 ISO+HYD組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠體質(zhì)量變化及血清BNP濃度（±s）

2.4 BNP濃度的比較 ISO組大鼠血清BNP水平較其他兩組升高（P＜0.05），ISO+HYD組大鼠血清BNP水平高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.5 三組大鼠血清中CHOP、GRP78濃度的比較 ISO組大鼠血清CHOP濃度較其他兩組升高（P＜0.05），ISO+HYD組大鼠血清CHOP濃度水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。ISO組大鼠血清GRP78濃度較其他兩組升高（P＜0.05），ISO+HYD組大鼠血清GRP78濃度水平高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 三組大鼠血清CHOP和GRP78濃度指標(biāo)比較（ng／ml，±s）

2.6 蛋白質(zhì)羰基濃度檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組、ISO+HYD組及ISO組大鼠心肌和骨骼肌中蛋白質(zhì)羰基濃度均依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 三組大鼠心肌和骨骼肌中蛋白羰基濃度（μmol／g，±s）

2.7 心肌和骨骼肌中CHOP、GRP78 m RNA表達(dá)的比較 對(duì)照組、ISO+HYD組及ISO組大鼠心肌和骨骼肌中CHOP、GRP78 mRNA的表達(dá)量均依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠骨骼肌和心肌中CHOP、GRP78 m RNA的相對(duì)表達(dá)量

2.8 免疫熒光檢測(cè)蛋白質(zhì)羰基表達(dá)結(jié)果 對(duì)照組、ISO+HYD組及ISO組大鼠心肌和骨骼肌免疫熒光染色見(jiàn)圖2。采用ImageJ軟件檢測(cè)每組染色片子的平均熒光強(qiáng)度，平均熒光強(qiáng)度依次增高（P＜0.05），見(jiàn)表6。

圖2 蛋白質(zhì)羰基化免疫熒光染色 SP×100

表6 三組大鼠心肌和骨骼肌中蛋白質(zhì)羰基平均熒光強(qiáng)度（±s）

2.9 蛋白質(zhì)羰基化與血清CHOP、GRP78濃度之間相關(guān)性分析 三組大鼠心肌和骨骼肌內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化濃度與血清CHOP和GRP78濃度的相關(guān)系數(shù)均為正值，且P＜0.05，說(shuō)明蛋白質(zhì)羰基化與CHOP、GRP78濃度之間存在正相關(guān)，見(jiàn)表7。

表7 蛋白質(zhì)羰基化濃度與血清CHOP、GRP78濃度相關(guān)系數(shù)

3 討論

目前心力衰竭惡病質(zhì)發(fā)病率逐年上升，已成為一個(gè)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，有研究證實(shí)其發(fā)病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究建立大鼠的心力衰竭惡病質(zhì)模型，重點(diǎn)在于通過(guò)應(yīng)用抗氧化劑HYD抑制氧化應(yīng)激，探討蛋白質(zhì)羰基化在心力衰竭惡病質(zhì)發(fā)生發(fā)展中的作用。相關(guān)的研究數(shù)據(jù)表明BNP是診斷心力衰竭快速而又敏感的生物標(biāo)志物，其濃度越高，表示心力衰竭的情況越嚴(yán)重，本研究結(jié)果表明 ISO組大鼠BNP濃度高于ISO+HYD組和對(duì)照組，這也就是說(shuō)抗氧化劑HYD降低了大鼠心力衰竭的嚴(yán)重程度，從而減少了大鼠心力衰竭惡病質(zhì)的發(fā)病率。我們通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)羰基化的水平，ISO組高于對(duì)照組和ISO+HYD組，這表明使用強(qiáng)抗氧化劑HYD后，抑制了蛋白質(zhì)羰基化的形成，從而進(jìn)一步抑制了心力衰竭惡病質(zhì)的進(jìn)展。通過(guò)免疫熒光試驗(yàn)可直接證實(shí)：與其他兩組比較，ISO組大鼠心肌和骨骼肌中細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)羰基化蛋白質(zhì)點(diǎn)片狀聚集表達(dá)明顯增多，借助ImageJ軟件所測(cè)得的平均熒光強(qiáng)度也是ISO組最強(qiáng)，ISO+HYD組次之，對(duì)照組也檢測(cè)到少量的熒光，這符合在正常的生理過(guò)程中也存著一定水平的蛋白質(zhì)羰基化。

蛋白質(zhì)羰基化不僅是氧化應(yīng)激的結(jié)果，另外，蛋白質(zhì)羰基化也是線粒體功能障礙和ERS的起始因子。CHOP屬于C／EBP家族的一員，又叫做生長(zhǎng)抑制DNA損傷基因153抗原（GADD153），在ERS中介導(dǎo)凋亡反應(yīng)的發(fā)生。通常情況下CHOP的表達(dá)非常低，在ERS應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，CHOP的表達(dá)增加，這會(huì)加速細(xì)胞凋亡；相反，CHOP缺乏可以保護(hù)細(xì)胞免受ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。GRP78是一種多功能蛋白，當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，未折疊蛋白或者錯(cuò)誤折疊蛋白聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，啟動(dòng)GRP78釋放三種ERS感受蛋白，激活未折疊蛋白反應(yīng)，從而啟動(dòng)細(xì)胞的促生存機(jī)制。通過(guò)三組大鼠蛋白質(zhì)羰基化濃度與血清CHOP、GRP78濃度相關(guān)分析性分析，表明ISO組大鼠心肌和骨骼肌內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化濃度與血清CHOP、GRP78蛋白濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，即心力衰竭惡病質(zhì)大鼠心肌和骨骼肌內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化濃度越高，血清CHOP、GRP78濃度越高，ERS越明顯。

本研究通過(guò)熒光定量PCR的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在ISO所致的心力衰竭惡病質(zhì)大鼠的心肌和骨骼肌中，CHOP、GRP78 mRNA水平明顯升高，抗氧化劑HYD的治療可減輕ERS，這是ISO+HYD組大鼠心肌和骨骼肌中CHOP、GRP78 mRNA水平的顯著降低所證實(shí)的。ELISA的試驗(yàn)結(jié)果表明，ISO組大鼠血清中CHOP和GRP78明顯高于ISO+HYD組和對(duì)照組，這表明心力衰竭惡病質(zhì)大鼠體內(nèi)出現(xiàn)了明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，這與林可等所證實(shí)的CHOP和GRP78在心力衰竭大鼠心肌中過(guò)表達(dá)，并且參與了心肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程相一致。