芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯對高胰島素誘導足細胞功能損傷的影響

黃瓊芳，趙天嬌，蘇揚妮，黃 瓊，魏 偉

糖尿病腎病（diabetic nephripathy，DN）是糖尿病的常見并發癥，其發病機制十分復雜。高胰島素血癥（hyperinsulinism，HINS）是DN的主要臨床表現，能夠促進DN的發生和發展，加重腎損傷。足細胞是腎小球高度分化的固有細胞，是維持腎小球濾過屏障功能正常的主要細胞。DN長時期的高胰島素環境能夠誘導足細胞損傷和凋亡，促進腎小球濾過屏障的破壞和組織學變化，包括腎小球系膜擴張、腎小球間質纖維化和腎小球硬化等。

白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）主要成分為芍藥苷（paeoniflorin，Pae）。據報道，TGP能夠延緩 DN的惡化。芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯（phenylsulfonylpaeoniflorin，CP-25）是 TGP的結構修飾產物，其抗炎免疫調節能力和生物利用度更優于Pae。但CP-25對DN的研究尚無報道。該研究擬以永生化小鼠足細胞為對象，探討CP-25對高胰島素誘導的足細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 CCK-8試劑盒（日本同仁化學公司）；8μm Transwell小室（美國 Corning公司）；GOD-POD試劑盒（上海貝博有限公司）；胰島素（Sigma公司）；β-actin（北京中杉金橋有限公司）；兔抗Nephrin蛋白多克隆抗體（Thermo Scientifi公司）；Annexin V-FITC／PI細胞凋亡檢測試劑盒（日本同仁化學公司）；胰酶消化液（Beyotime公司）；細胞培養液（Hyclone公司）；胎牛血清（Gbico公司）；青霉素-鏈霉素溶液（Beyotime公司）；足細胞株（北京北納創聯生物技術研究院）；CP-25由安徽醫科大學臨床藥理研究所合成，純度大于98%。

1.2 方法

1.2.1 足細胞的培養 待細胞在培養瓶中融合至70%～80%時，此時進行傳代，棄去培養基，加無菌PBS洗滌2～3次，加入200μl胰酶消化液進行消化，在顯微鏡下觀察，待細胞變圓皺縮時，棄去消化液，加入新的培養基終止消化，緩慢吹打均勻制成單細胞懸液，隨后將細胞懸液轉移至新的細胞培養瓶中，放入33℃細胞培養箱，待足細胞增殖至50%～60%時，轉移至37℃，5% CO的細胞培養箱進行分化7～14 d。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 足細胞被消化后，以1×10個細胞／孔的密度接種于96孔板中，分別設置空白對照組、高胰島素組、高胰島素+CP-25（0.1、1、10μmol／L）組、高胰島素 +二甲雙胍（3 mmol／L）組刺激48 h，每組設置5～6個復孔，結束后每孔加入10μl CCK-8試劑后避光繼續培養，于酶標儀中檢測1、2、3、4 h的吸光度，檢測波長為450 nm。

1.2.3 GOD-POD法檢測葡萄糖消耗 足細胞被消化后，以1×10個細胞／孔的密度接種于96孔板中，分組與加藥處理同“1.2.2”項，每組設置5～6個復孔，刺激48 h結束后，棄去上清液，換用無酚紅DMEM培養基繼續培養24 h。取3μl上清液加300 μl GOP-POD工作液在37℃培養箱中孵育15 min，設置空白孔（雙蒸水）和標準孔（標準液），用酶標儀檢測波長505 nm處的吸光度。

1.2.4 Annexin V-FITC／PI流式細胞術檢測細胞凋亡 足細胞被消化后，以1×10個細胞／孔的密度接種于6孔板中，分組與加藥處理同“1.2.2”項，加胰酶消化液將板中的細胞消化下來，離心后收集各組細胞，加入1×Annexin V Binding Solution，配制細胞懸液終濃度為1×10個／ml。在流式管中加入200μl上一步制得的懸液，加入5μl Annexin VFITC結合物和5μl PI Solution，避光15 min，在1 h內流式細胞儀檢測。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移能力 將8μm小室放于24孔板中，在 Transwell下室中加入含有10%胎牛血清的DMEM培養液，分組與加藥處理同“1.2.2”項；用無血清的DMEM將足細胞配制成一定濃度的單細胞懸液，按2×10個細胞／孔的密度將細胞懸液接種于Transwell小室的上室中。放于37℃，5% CO培養箱中孵育48 h，取出小室，用結晶紫染色7 min左右，PBS漂洗，用棉簽擦拭去殘留的水分和Transwell上室沒有遷移成功的細胞，將小室倒置于顯微鏡下觀察，并計數拍照。

1.2.6 Western blot檢測相關蛋白表達 取生長狀況良好的足細胞，分組與加藥處理同“1.2.2”項，48 h后，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，留取少量進行BCA檢測蛋白濃度，其余加入5×蛋白上樣緩沖液，在沸水中煮7～8 min；將蛋白樣品加入到配好的凝膠中，進行SDS-PAGE電泳，結束后進行轉膜，用含5%的脫脂奶粉的Tween20-PBS溶液在37℃搖箱中封閉2 h后，Tween20-PBS洗滌3次，PBS洗滌1次，每次10min；一抗4℃孵育過夜；Tween 20-PBS洗滌3次，二抗37℃搖箱中孵育2 h。于化學發光儀進行顯影。利用Image J計算其灰度值，以β-actin為內參。

2 結果

2.1 高胰島素對足細胞Nephrin的影響 用不同濃度的胰島素（10μmol／L、1μmol／L、100 nmol／L、10 nmol／L）刺激足細胞，與空白對照組比較，胰島素（10μmol／L）組（0.065±0.031）、胰島素（1μmol／L）組（0.808±0.079）刺激足細胞能夠降低足細胞的損傷因子Nephrin的蛋白表達，差異有統計學意義（F＝8.773，P＜0.01），見圖 1，后續實驗選取胰島素 （10μmol／L）進行誘導。

圖1 不同濃度胰島素誘導的足細胞Nephrin的蛋白表達

2.2 CP-25對高胰島素誘導足細胞增殖率的影響 高胰島素誘導足細胞損傷，用 CP-25（0.1、1、10 μmol／L）、二甲雙胍分別處理細胞，檢測足細胞的增殖能力。CCK-8法結果顯示：與空白對照組比較，高胰島素組足細胞的增殖率降低，差異有統計學意義（P＜0.01），與高胰島素組比較，CP-25（0.1μmol／L）組、CP-25（1μmol／L）組、CP-25（10μmol／L）組、二甲雙胍組處理后能夠使足細胞的增殖率有不同程度的增加，且與濃度呈正相關（F＝23.269，P＜0.01），見表1。

表1 CP-25對高胰島素誘導的足細胞增殖的影響（n＝3，±s）

2.3 CP-25對高胰島素誘導足細胞葡萄糖消耗的影響 GOD-POD結果顯示：與空白對照組（3.980±0.100）比較，高胰島素組（2.947±0.110）處理能夠降低足細胞對葡萄糖的攝取，差異有統計學意義（P＜0.01）。與高胰島素組比較，CP-25（1μmol／L）組（3.328±0.343）、CP-25（10μmol／L）組（3.458±0.322）、二甲雙胍組（3.763±0.280）處理后能夠升高足細胞的葡萄糖消耗（F＝9.637，P＜0.05或P＜0.01），見圖2。

圖2 CP-25對足細胞的葡萄糖消耗的影響

2.4 CP-25對高胰島素誘導足細胞凋亡的影響 與空白對照組（3.317±0.67）%比較，高胰島素組（11.703±1.470）%誘導能夠明顯上調足細胞的凋亡率，差異有統計學意義（P＜0.01）。與高胰島素組比較，CP-25（0.1μmol／L）組（9.277±1.587）%、CP-25（1μmol／L）組（6.533±1.119）%、CP-25（10 μmol／L）組（5.145±0.515）%、二甲雙胍組（4.403±0.669）%處理后能夠顯著降低足細胞的凋亡，差異有統計學意義（F＝25.816，P＜0.05或 P＜0.01），見圖3。

圖3 CP-25對足細胞的凋亡率的影響

2.5 CP-25對高胰島素誘導的足細胞遷移的影響 Transwell結果顯示：與空白對照組（269.433±20.967）比較，高胰島素組（522.467±24.587）誘導的足細胞損傷后，能夠明顯增加遷移到Transwell下室的細胞數（P＜0.01）。與高胰島素組比較，CP-25（0.1μmol／L）組 （456.900±17.700）、CP-25（1 μmol／L）組（395.100±30.399）、CP-25（10μmol／L）組（355.330±33.620）、二甲雙胍組（287.000±384.946）處理后能夠抑制足細胞的遷移（F＝35.227，P＜0.01），見圖4。

圖4 CP-25對足細胞遷移的影響 ×40

2.6 CP-25對高胰島素誘導足細胞Nephrin蛋白表達的影響 Western blot結果顯示：與空白對照組比較，高胰島素組足細胞Nephrin的表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。與高胰島素組（0.632±0.045）比較，CP-25（0.1μmol／L）組（0.836±0.065）、CP-25（1μmol／L）組（0.935±0.082）、CP-25（10μmol／L）組（0.996±0.058）、二甲雙胍組（0.984±0.060）處理后能夠上調足細胞Nephrin的表達，差異有統計學意義（F＝19.297，P＜0.01），見圖5。

圖5 CP-25對足細胞Nephrin的蛋白表達的影響

3 討論

足細胞是排列在腎小球基底膜外表面的細胞，其主要功能是與腎小球基底膜和內皮細胞共同組成腎小球的濾過屏障，調節腎小球的濾過功能。足細胞的損傷能夠導致其黏附性的喪失，這是DN發展的主要原因。已有研究表明，足細胞高表達胰島素受體，胰島素能夠調節足細胞的許多功能，因此有學者認為在胰島素抵抗中，血清中高濃度的胰島素可以通過直接調節足細胞的生物學功能，進而影響腎小球的作用，并且其作用時間和濃度有較大差別。本研究驗證了高濃度的胰島素對足細胞功能的影響。我們在體外用不同濃度的胰島素對足細胞進行誘導，模擬了DN胰島素抵抗患者高濃度胰島素狀態。結果發現10μmol／L的胰島素處理足細胞能夠引起細胞的胰島素抵抗，比如細胞的凋亡率增高，細胞對葡萄糖的攝取能力和增殖率也明顯受到抑制。Nephrin是免疫球蛋白超家族成員，并且在腎臟中特異性表達于足細胞，研究證實，Nephrin的正常表達是足細胞裂孔膜結構的必要條件。而高胰島素刺激足細胞后能夠明顯地降低Nephrin的表達，本研究表明在DN環境中，足細胞會產生胰島素抵抗，降低細胞的糖代謝能力，在一定程度上，是由于長期暴露于升高的胰島素水平中而引起的，因此HINS可能進一步加重糖尿病狀態下腎臟疾病的進展。

CP-25是由Pae進行結構修飾得到的單體，其具有良好的抗炎免疫調節作用。但CP-25對DN的研究尚無報道。在我們的研究中，CP-25處理增加了足細胞對葡萄糖的攝取能力，恢復了細胞活力和Nephrin的表達，抑制了高胰島素狀態下足細胞的凋亡和遷移能力。結果提示CP-25改善了高胰島素誘導的足細胞功能損傷，此外，我們也證明了Nephrin的表達對足細胞功能的完整性是必需的，而CP-25處理明顯升高了Nephrin的表達，進而對腎小球損傷起到了一定的保護作用。

綜上所述，高濃度胰島素能夠誘導足細胞功能的損傷，下調足細胞Nephrin的蛋白表達。而CP-25能夠改善高胰島素引起的足細胞功能損傷，該結果可能與升高足細胞的表面特征蛋白Nephrin有關，其具體作用機制需要進一步深入研究。