CCL23及其受體CCR1與人上皮性卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的研究

孫 磊，張 英，朱 潁，李澤蓮，顏士杰，肖 蘭

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是卵巢癌中最為常見(jiàn)的類型之一，因其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)常為晚期，且規(guī)范治療后易發(fā)生鉑類耐藥導(dǎo)致患者預(yù)后較差。該課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，EOC組織趨化因子配體 23（C-C chemokine ligand 23，CCL23）及趨化因子受體1（C-C chemokine receptor 1，CCR1）表達(dá)水平明顯高于正常卵巢上皮組織，提示CCL23及其受體CCR1可能參與EOC發(fā)生發(fā)展過(guò)程。為了進(jìn)一步了解 CCL23及其受體CCR1與EOC順鉑耐藥之間關(guān)系，該研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染將CCL23導(dǎo)入CCL23表達(dá)較低的OV2008細(xì)胞，再聯(lián)合 CCR1抑制劑 BX471，旨在探討CCL23／CCR1趨化因子受體軸在EOC順鉑耐藥中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑 細(xì)胞株：人EOC耐藥細(xì)胞C13K及人EOC敏感細(xì)胞OV2008均為安徽醫(yī)科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室保存；1640培養(yǎng)基、PBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)GIBGO公司；RIPA裂解液、BCA法蛋白濃度定量試劑盒、CCK-8檢測(cè)試劑盒、ECL顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；BX471試劑購(gòu)自上海碧云天公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)InvitroGen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；CCL23抗體及CCR1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；YAP抗體購(gòu)自美國(guó) CST公司；LV5-CCL23過(guò)表達(dá)慢病毒購(gòu)自上海吉瑪公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) C13K細(xì)胞和OV2008細(xì)胞用含15%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，在5% CO、37℃條件下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ① 轉(zhuǎn)染前1 d在6孔板中以（1～1.5）×10個(gè)／孔接種相應(yīng)濃度處于對(duì)數(shù)期OV2008細(xì)胞；②轉(zhuǎn)染分組：CCL23過(guò)表達(dá)組及空載體組；③按照MOI值為75行慢病毒轉(zhuǎn)染，37℃孵育箱中孵育，48～72 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率；④ 待細(xì)胞長(zhǎng)至70% ～80%時(shí)，5μg／ml嘌呤霉素篩選 14 d，得到 CCL23過(guò)表達(dá)及空載體OV2008陽(yáng)性克隆株。

1.2.3 倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光表達(dá) 倒置熒光顯微鏡下觀察處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CCL23過(guò)表達(dá)及空載體OV2008陽(yáng)性克隆內(nèi)綠色熒光表達(dá)，圖片經(jīng)圖像處理軟件Image J統(tǒng)一進(jìn)行處理以獲得更好的顯示結(jié)果。

1.2.4 平板克隆 空白對(duì)照OV2008細(xì)胞、CCL23過(guò)表達(dá)及空載體OV2008陽(yáng)性克隆株分別以500個(gè)／孔細(xì)胞接種于6孔板中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置于5% CO、37℃，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d。當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清液，PBS小心浸洗2次。2 ml甲醇固定細(xì)胞15 min，棄去固定液，加適量吉姆薩液染色15～30 min，流水緩慢洗去染液，空氣中干燥。計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)目，計(jì)算克隆形成率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)順鉑IC及細(xì)胞增殖活性 空白對(duì)照 OV2008細(xì)胞、CCL23過(guò)表達(dá)及空載體OV2008陽(yáng)性克隆株分別以1×10個(gè)／孔濃度接種于96孔板，24 h后更換含有不同濃度順鉑培養(yǎng)基（順鉑濃度：0、1、5、10、20μmol／L），設(shè)5個(gè)復(fù)孔。48 h后每孔加入10μl的CCK-8，孵育箱培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度OD值；另一板同時(shí)每個(gè)孔再加入20μmol／L的BX471工作液，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，余下步驟同上。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)CCL23、CCR1 mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為 37℃、15 min；80℃、5 s；4℃、5 min。合成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，β-actin為內(nèi)參對(duì)照，反應(yīng)條件為95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，40次循環(huán)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果按2法計(jì)算各組細(xì)胞中CCL23 mRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。CCL23基因引物序列，上游；GCTGACTGCTGCATCTCCTACAC；下游：GGCTTGGAGCACTCGCTGTTC。CCR1基因引物序列，上游：GGGAAAGGTGGCCAAACACT；下 游：TGCTCATGGTGGAAGAAGTCC；β-actin基因引物序列，上游：GTGGCCGAGGACTTTGATTG，下 游：CCTGTAACAACGCATCTCATATT。

1.2.7 Western blot檢測(cè) CCL23、CCR1、YAP蛋白水平 采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA試劑盒定量，SDS-PAGE中行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用封閉液封閉2 h，之后加入一抗過(guò)夜，二抗孵育2 h，用ECL觀察印跡并使用成像系統(tǒng)檢測(cè)印跡并拍照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用圖像處理軟件 Image J統(tǒng)計(jì) CCL23、CCR1、YAP蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞C13K與OV2008中CCL23、CCR1 m RNA表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示C13K中CCL23及CCR1 mRNA表達(dá)水平均高于OV2008，表達(dá)水平分別為（5.53±1.23）、（1.07±0.46）（t＝-5.853，P＜0.01）、（4.36±0.52）、（1.10±0.56）（t＝-7.414，P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá) 熒光顯微鏡下可見(jiàn)CCL23過(guò)表達(dá)及空載體OV2008陽(yáng)性克隆株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，滿視野綠色熒光表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá) ×200

2.3 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 OV2008細(xì)胞 CCL23及CCR1 m RNA表達(dá) qRT-PCR證實(shí)CCL23過(guò)表達(dá)OV2008陽(yáng)性克隆株CCL23 mRNA表達(dá)增加，空白對(duì)照OV2008細(xì)胞、空載體及CCL23 mRNA過(guò)表達(dá)OV2008細(xì)胞陽(yáng)性克隆株CCL23 mRNA表達(dá)分別為（0.98±0.29）、（1.08±0.56）及 （3 211.16±184.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝912.249，P＜0.001），三者CCR1 mRNA表達(dá)水平分別為（1.08±0.19）、（1.04±0.36）和（1.03±0.31），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.021，P＞0.05）。

2.4 CCL23過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞存活率及順鉑IC的影響 順鉑作用48 h，CCL23過(guò)表達(dá)OV2008細(xì)胞存活率提高（F＝26.980，P＜0.01），CCL23過(guò)表達(dá)OV2008細(xì)胞 IC為（9.50±0.65）μmol／L，高于空白對(duì)照 OV2008細(xì)胞 IC（5.36±0.61）μmol／L及慢病毒空載體 OV2008細(xì)胞 IC（5.56±0.65）μmol／L（F＝39.859，P＜0.01），見(jiàn)圖2、3和表 1。

表1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活率比較（%，±s，n＝3）

圖2 順鉑作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響

圖3 CCL23過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞IC50的影響

2.5 CCL23過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞克隆形成影響 肉眼可見(jiàn)CCL23過(guò)表達(dá)OV2008細(xì)胞克隆形成能力高于空白對(duì)照組及空載體組OV2008細(xì)胞，CCL23過(guò)表達(dá)OV2008細(xì)胞平均克隆形成率為（61.00±7.55）%，空白對(duì)照OV2008細(xì)胞平均克隆形成率為（28.53±2.60）%，慢病毒空白載體OV2008細(xì)胞平均克隆形成率為（34.47±3.83）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝32.825，P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 細(xì)胞克隆形成能力改變

2.6 BX471干預(yù)前后細(xì)胞存活率及順鉑IC比較BX471聯(lián)合順鉑處理空白對(duì)照OV2008細(xì)胞、CCL23過(guò)表達(dá)OV2008細(xì)胞及空載體OV2008細(xì)胞48 h，與單獨(dú)順鉑處理細(xì)胞比較，聯(lián)合BX471干預(yù)后三組細(xì)胞對(duì)順鉑IC均有所下降，CCL23過(guò)表達(dá)組由（8.98±0.27）μmol／L降至（4.46±0.45）μmol／L（t＝15.093，P＜0.001），空白對(duì)照組由（5.19±0.59）μmol／L降至 （2.51±0.25）μmol／L（t＝7.234，P＜0.01），空白載體組由（5.37±1.01）μmol／L降至（2.67±0.56）μmol／L（t＝4.059，P＜0.01），空白對(duì)照 OV2008細(xì)胞存活率（t＝17.000，P＜0.001）、空載體 OV2008細(xì)胞存活率（t＝9.384，P＜0.001）及CCL23過(guò)表達(dá)OV2008細(xì)胞存活率（t＝6.08，P＜0.01）均下降，見(jiàn)圖5及表2。

表2 BX471干預(yù)前后轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活率比較（%，±s，n＝3）

圖5 BX471干預(yù)前后細(xì)胞IC50比較

2.7 BX471干預(yù)前后各組細(xì)胞CCL23、CCR1及YAP蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示：BX471處理各組細(xì)胞前，CCL23過(guò)表達(dá)后，OV2008細(xì)胞中CCL23蛋白升高，而 CCR1及 YAP蛋白無(wú)改變，BX471處理各組細(xì)胞后，細(xì)胞中CCR1蛋白表達(dá)均有所抑制（t＝30.074，t＝27.174，t＝24.470，均 P＜0.01），CCL23蛋白水平亦降低（t＝23.687，t＝38.312，t＝34.237，均 P＜0.01），同時(shí)細(xì)胞中YAP蛋白水平亦有所降低（t＝17.271，t＝23.396，t＝27.717，均 P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 BX471處理前后各組細(xì)胞蛋白的變化

3 討論

趨化因子作為組成細(xì)胞因子的重要部分，在癌癥的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程發(fā)揮著重要作用。例如，Han et al發(fā)現(xiàn)CCL7能夠加快非小細(xì)胞肺癌的侵襲、遷移和骨轉(zhuǎn)移，同時(shí)CCL7的表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；陸進(jìn) 等研究指出CCL23與肝癌患者預(yù)后相關(guān)；Su et al研究則表明CCL20與卵巢癌多柔比星耐藥相關(guān)。

本研究中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)人EOC順鉑耐藥細(xì)胞中CCL23與CCR1的mRNA水平均明顯高于人EOC順鉑敏感細(xì)胞，表明CCL23與CCR1高表達(dá)可能參與人EOC順鉑耐藥。我們通過(guò)慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染使順鉑敏感細(xì)胞OV2008過(guò)表達(dá)CCL23，體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果提示：過(guò)表達(dá)CCL23增加了OV2008細(xì)胞對(duì)順鉑耐受性，提高了細(xì)胞增殖活性。這與Lu et al通過(guò)高通量基因組學(xué)測(cè)序得出CCL23等多個(gè)趨化因子在卵巢癌中可能作為耐藥基因的結(jié)果相符。而CCL23過(guò)表達(dá)并未能改變細(xì)胞中CCR1水平，針對(duì)這一現(xiàn)象我們對(duì)CCL23／CCR1介導(dǎo)的EOC順鉑耐藥機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

CCR1作為多個(gè)趨化因子的受體，可與不同配體結(jié)合后發(fā)揮功能，抑制CCR1可阻斷其配體發(fā)揮相應(yīng)功能。Kato et al研究發(fā)現(xiàn)敲除CCR1后會(huì)降低高表達(dá)CCL5的前列腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉烷耐藥性。CCR1是CCL23唯一特異性受體，可與CCL23特異性結(jié)合，發(fā)揮多種生物學(xué)功能。Hwang et al指出CCL23結(jié)合CCR1后促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和遷移，CCR1拮抗劑可抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生存及遷徙。針對(duì)CCL23需與CCR1特異性結(jié)合才發(fā)揮作用這一特征，本研究運(yùn)用CCR1拮抗劑BX471，旨在探討抑制CCR1阻斷其結(jié)合配體 CCL23對(duì)EOC順鉑耐藥的作用。結(jié)果顯示BX471干預(yù)后各組細(xì)胞CCR1與CCL23表達(dá)均明顯下調(diào)，細(xì)胞對(duì)順鉑的IC與增殖活性亦受到一定抑制，細(xì)胞中YAP蛋白表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。YAP為HIPPO通路的一個(gè)下游因子，與多種腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)。由此推論：CCL23／CCR1趨化因子受體軸在EOC細(xì)胞順鉑耐藥中發(fā)揮作用，CCR1抑制劑BX471可能通過(guò)與CCL23競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CCR1，阻斷 CCL23對(duì)其下游效應(yīng)因子YAP的調(diào)控，從而恢復(fù)OV2008細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性。

綜上所述，CCL23／CCR1趨化因子受體軸通過(guò)調(diào)控細(xì)胞耐藥蛋白YAP，參與人EOC細(xì)胞順鉑耐藥，本研究有助于闡明CCL23／CCR1趨化因子受體軸作為上皮性卵巢癌潛在治療靶點(diǎn)的可行性。但CCL23／CCR1趨化因子受體軸通過(guò)激活哪些下游信號(hào)通路參與卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥還需進(jìn)一步探索。