羅格列酮對細(xì)菌脂多糖所致小鼠肺部炎癥和氧化應(yīng)激的保護(hù)效應(yīng)

丁章楠，博慶麗，費(fèi) 君，付 林，陸友金

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，病理表現(xiàn)為彌漫性肺間質(zhì)和肺泡水腫的疾病狀態(tài)。目前機(jī)械通氣聯(lián)合多方法的策略療效不佳。全球每年約有300萬患者，病死率為35% ～46%。細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要毒性成分，正常人群持續(xù)暴露于低劑量LPS中，當(dāng)遭受重癥感染或多因素?fù)p傷致腸黏膜通透性增高后，機(jī)體可因?yàn)長PS暴露增加而產(chǎn)生膿毒血癥，病情進(jìn)展則可誘發(fā)ALI。過氧化物酶增殖體物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors gamma，PPARγ）參與調(diào)節(jié)炎癥與抗炎反應(yīng)。臨床降糖藥羅格列酮（rosiglitazone，RSG）是PPARγ特異性激動(dòng)劑。有研究表明，RSG可減輕LPS誘發(fā)的胎盤炎癥及氧化應(yīng)激損傷。但RSG對 LPS引起ALI過程中炎癥和氧化應(yīng)激的調(diào)控尚不清楚。該研究通過建立RSG保護(hù)LPS誘導(dǎo)小鼠ALI的模型，探討RSG減輕LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥及氧化應(yīng)激的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為SPF級(jí)CD-1雄鼠，購自于北京維通利華公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0011），7～8周齡，體質(zhì)量28～30 g。RSG購自于成都恒瑞制藥有限公司（批號(hào)：181216）；LPS購于美國Sigma公司（貨號(hào)：067M4035V）；角化細(xì)胞衍生趨化因子 （keratinocyte-derived chemokine，KC）（貨號(hào)：CSB-E17286m）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（貨 號(hào)：CSB-PA07427A0Rb）的ELISA試劑盒均購于武漢華美生物有限公司。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-2，NOX-2）（貨號(hào)：ab80508）、NOX-4（貨號(hào)：D21F6）和 β-actin（貨號(hào)：ab179467）一抗均購自于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 32只CD-1雄鼠隨機(jī)均分成四組：對照組、RSG組、LPS 6 h組和RSG+LPS 6 h組。LPS組及RSG+LPS 6 h組經(jīng)腹腔注射給予小鼠單次暴露LPS（2 mg／kg）；RSG組及RSG+LPS 6 h組于LPS注射前連續(xù)4 d，每天1次經(jīng)口灌胃給予RSG（10mg／kg）。LPS注射后6 h用異氟烷麻醉小鼠，采用頸椎脫臼法處死小鼠，留取血清和肺組織，右肺下葉肺組織用多聚甲醛固定制備病理標(biāo)本，左肺下葉立即液氮速凍留作備用。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵從安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心倫理委員會(huì)章程 （批準(zhǔn)號(hào)：16-0010），符合倫理委員會(huì)的要求。

1.2.2 肺組織病理學(xué)檢測 取材結(jié)束后，取小鼠右肺下葉置于10%多聚甲醛溶液中固定24 h后，石蠟包埋切片，切片以后進(jìn)行HE染色。采用Fei et al的方法，將制備好的病理切片置于顯微鏡下，隨機(jī)選取12個(gè)視野，對小鼠肺組織進(jìn)行病理評(píng)分，評(píng)價(jià)肺組織損害程度。

1.2.3 ELISA試驗(yàn) 將ELISA試劑盒從4℃冰箱拿出，室溫平衡30 min，然后待用。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)孔中按順序加入標(biāo)準(zhǔn)品100 μl，待測品孔中每孔加入100μl待測樣品，留2個(gè)空白孔作為對照組，加入一抗工作液50μl。用封口膜蓋住96孔板，將體系置于37℃恒溫箱中孵育2.5 h。加入300μl洗滌液，振蕩2 min，然后甩凈洗滌液，用濾紙吸干多余的液體，重復(fù)洗滌4次。加入酶標(biāo)抗體工作液50μl，繼續(xù)37℃孵育1.5 h。重復(fù)洗板后，每孔加入底物工作液100μl，繼續(xù)37℃反應(yīng)30 min。每孔加入100μl反應(yīng)終止液，混勻后在450 nm波長處用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，重復(fù)檢測3次，5 min內(nèi)完成檢測，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算KC和TNF-α的濃度。

1.2.4 肺組織總蛋白的提取與Western blot 稱取35 mg肺組織到玻璃勻漿器中，加入0.5 ml RIAP裂解液，冰上勻漿40次，勻漿完成后倒入1.5 ml EP管中，然后在4℃離心機(jī)15 000 r／min離心15 min，吸取上清液300μl后用BCA法檢測肺組織蛋白濃度，加入Loading Buffer將所有樣品蛋白定至同一濃度。固定玻璃卡槽，灌入分離膠和濃縮膠，膠凝固后拔出梳子，加入相同體積的蛋白樣品。然后內(nèi)槽加滿電泳緩沖液開始電泳，待溴酚藍(lán)跑到底部，停止電泳開始轉(zhuǎn)膜，然后牛奶封閉，孵育一抗和二抗，最后洗膜，滴加ECL發(fā)光液，檢測灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，對 p-IκBɑ、IκBɑ、p-p65、NOX-4及 NOX-2的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 RSG預(yù)處理減輕LPS誘發(fā)小鼠ALI 與對照組比較，LPS急性暴露后小鼠絕對肺質(zhì)量由0.18 g上升至0.20 g（F＝20.321，P＜0.01），相對肺系數(shù)由0.50%上調(diào)至 0.68%（F＝12.214，P＜0.01）；RSG預(yù)處理后，雖然對LPS引起的相對肺系數(shù)的降低差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可以抑制LPS暴露所致小鼠絕對肺質(zhì)量的升高（F＝6.541，P＜0.05），見圖1。進(jìn)一步觀察小鼠肺組織病理學(xué)的改變發(fā)現(xiàn)，LPS暴露后，小鼠肺間質(zhì)及肺泡水腫、出血，炎癥細(xì)胞浸潤增加，病理評(píng)分升高至5.7分（F＝101.021，P＜0.01）；而RSG預(yù)處理以后，可減輕LPS暴露所致肺泡結(jié)構(gòu)損傷及炎癥細(xì)胞浸潤，小鼠肺臟病理學(xué)評(píng)分也降低至2.0分（F＝42.123，P＜0.01）。見圖2。

圖1 小鼠肺組織絕對肺質(zhì)量和相對肺系數(shù)

圖2 小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)價(jià)

2.2 RSG預(yù)處理減輕LPS誘發(fā)小鼠肺部炎癥 與對照組比較，LPS的暴露致小鼠肺組織中KC濃度升高至 1 700 pg／ml（F＝34.125，P＜0.01）、TNF-α濃度由160 pg／ml升高至 340 pg／ml（F＝22.321，P＜0.01）；而RSG處理預(yù)處理后，LPS暴露組肺組織 KC降低至 600 pg／ml（F＝18.921，P＜0.01）、TNF-α降低至250 pg／ml（F＝9.854，P＜0.01）。見圖3。

圖3 小鼠肺組織KC、TNF-α水平

2.3 RSG預(yù)處理抑制LPS暴露激活肺部NF-κB信號(hào)通路 與對照組比較，LPS暴露后小鼠肺組織IκBα及 NF-κB p65的磷酸化水平增高 （F＝120.235，P＜0.01；F＝95.657，P＜0.01），而 IκBα表達(dá)水平降低（F＝56.854，P＜0.01）。而 RSG預(yù)處理可抑制LPS暴露所致IκBα及NF-κB p65的磷酸化（F＝4.526，P＜0.05；F＝8.652，P＜0.01），上調(diào) IκBα表達(dá)（F＝2.354，P＜0.05）。見圖4。

圖4 小鼠肺組織NF-κB信號(hào)

2.4 RSG預(yù)處理減輕LPS暴露所致對肺部NOX-4表達(dá)上調(diào) 與對照組比較，LPS腹腔注射后可誘導(dǎo)小鼠肺組織 NOX-2及 NOX-4表達(dá)升高（F＝23.894，P＜0.01；F＝36.452，P＜0.01）；而 RSG預(yù)處理可有效抑制LPS暴露上調(diào)小鼠肺組織NOX-4的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝15.635，P＜0.01）。而RSG預(yù)處理對LPS上調(diào)小鼠肺組織NOX-2表達(dá)的升高雖然有抑制的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖5 小鼠肺組織NOX-2及NOX-4表達(dá)

3 討論

本研究結(jié)果表明，在經(jīng)腹腔單次注射LPS后，小鼠肺組織病理顯示肺間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡及肺間質(zhì)彌漫性水腫，肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，提示腹腔注射LPS成功構(gòu)建小鼠ALI模型。而在RSG預(yù)處理后，LPS所致小鼠ALI模型中肺組織的損傷及炎性細(xì)胞浸潤程度均減輕，提示RSG預(yù)處理可以減輕LPS所致的小鼠ALI。

促炎因子TNF-α在炎癥反應(yīng)中參與血管擴(kuò)張及水腫的形成，可以促進(jìn)白細(xì)胞黏附上皮。當(dāng)機(jī)體LPS的暴露增多后，體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞可釋放大量TNF-α，其主要通過NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮促炎作用。NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在未激活時(shí)與它的抑制性亞基IκB結(jié)合在一起，停留在細(xì)胞質(zhì)中。而TNF-α可以通過IKK激酶復(fù)合體使IκBα蛋白磷酸化并迅速被降解，使得NF-κB可以從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，結(jié)合到DNA反應(yīng)結(jié)合元件上，上調(diào)炎癥因子的表達(dá)和釋放。KC作為小鼠體內(nèi)一種強(qiáng)效的中性粒細(xì)胞趨化因子，在炎癥反應(yīng)啟動(dòng)后，可于炎癥部位迅速募集大量中性粒細(xì)胞，加重局部炎癥反應(yīng)程度。本研究發(fā)現(xiàn)，在 LPS暴露后，小鼠肺組織中TNF-α和KC濃度增加，IκBα和p65磷酸化水平增高，表明LPS暴露通過產(chǎn)生肺部炎癥因子激活NF-κB信號(hào)，進(jìn)而激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)瀑布誘發(fā)ALI。而RSG預(yù)處理可以有效阻止LPS暴露上調(diào)肺部炎癥因子，抑制NF-κB信號(hào)的激活。以上結(jié)果表明RSG可能通過抑制NF-κB信號(hào)激活阻斷炎癥因子分泌，從而減輕LPS所致ALI。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一類含氧的化學(xué)物質(zhì)，包括氧分子、超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、過氧化脂質(zhì)、氧化物等。機(jī)體內(nèi)的ROS是吞噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬和殺傷作用的主要介質(zhì)。在炎癥致?lián)p下，由于ROS的產(chǎn)生和清除平衡被破壞，過量的ROS通過使DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜及亞細(xì)胞器膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。NOX作為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的重要來源之一，主要靠NOX-2、NOX-4兩個(gè)催化亞基產(chǎn)生活性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS暴露可上調(diào)小鼠肺組織NOX-2、NOX-4蛋白表達(dá)，提示氧化應(yīng)激可能參與了LPS誘發(fā)小鼠ALI。而RSG預(yù)處理后，在抑制LPS致?lián)p后小鼠肺部NOX-4蛋白表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，小鼠肺組織的損傷減輕。表明RSG可能通過抑制氧化應(yīng)激減少ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕LPS所致ALI。

PPARγ屬于Ⅱ型核受體超家族，在脂肪組織、巨噬細(xì)胞及肺組織中具有較高的表達(dá)，激活PPARγ可以減少趨化因子、ROS和黏附分子等的表達(dá)。RSG作為人工合成PPARγ激動(dòng)劑，現(xiàn)有的研究表明，補(bǔ)充RSG可激活胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞PPARγ，通過與胞質(zhì)和胞核中NF-κB p65發(fā)生相互作用，抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。本研究觀察中，使用 RSG預(yù)處理可以抑制LPS致?lián)p所引起的IκB的磷酸化，減少NF-κB解離及NF-κB p-65亞型磷酸化的濃度。我們推測，補(bǔ)充RSG可能是通過激活肺上皮細(xì)胞的PPARγ，促進(jìn)PPARγ在胞質(zhì)以及胞核與 NF-κB p65相互結(jié)合，抑制NF-κB p65轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而下調(diào)下游的炎癥因子產(chǎn)生，減輕LPS所致ALI。

綜上所述，RSG預(yù)處理可減輕LPS所致小鼠ALI，其保護(hù)機(jī)制可能是通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。而RSG作為緩解膿毒癥所致ALI的一種潛在藥物具有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。